АЛГОРИТМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МЕТАБОЛИЗМА АМИНОКИСЛОТ И АЦИЛКАРНИТИНОВ

АЛГОРИТМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МЕТАБОЛИЗМА АМИНОКИСЛОТ И АЦИЛКАРНИТИНОВ.

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

кандидат медицинских наук Захарова Екатерина Юрьевна

Носиков Валерий Вячеславович. доктор биологических наук, профессор

Государственный научный центр российской Федерации «ГосНИИгенетика», заведующий лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии

Ковалев Леонид Иванович. доктор биологических наук

Институт биохимии им.А.Н.Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, Отдел хроматографического анализа

Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2012 г.

диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских

и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

Актуальность проблемы. Наследственные нарушения метаболизма аминокислот, органических кислот и дефекты митохондриального β–окисления представляют одну из обширных групп наследственных болезней обмена (НБО) (более 100 нозологических единиц). При низкой частоте отдельных форм заболеваний их суммарная частота довольно высока и составляет 1:2000 – 1:3000 живых новорожденных (Vilarinho L. et al, 2010; Kasper D.C. et al, 2010; Luz Couce M. et al, 2011; Lindner M. et al, 2011). Большинство заболеваний из этой группы манифестируют в раннем детском возрасте, характеризуются острым течением и часто сопровождаются поражением нервной системы. При этом около 20 форм болезней из этой группы поддаются лечению, эффективность которого во многом зависит от сроков установления диагноза.

В диагностике многих форм заболеваний, обусловленных дефектами обмена аминокислот и других соединений, ключевую роль играет анализ содержания аминокислот, органических кислот, общего и свободного карнитина, а также ацилкарнитинов в различных биологических жидкостях. Одним из современных методов определения данных веществ является тандемная масс-спектрометрия (МС/МС), которая позволяет не только охарактеризовать структуру исследуемых веществ, но и провести количественную оценку множества соединений одновременно за короткое время (Chace D.H. 2001; Millington D.S. et al, 1991). Все это обеспечивает широкий спектр и высокую пропускную способность, что экономически выгодно для скрининга на большое число заболеваний. За рубежом МС/МС анализ уже многие годы применяется для массового скрининга на НБО (Kasper D.C. et al, 2010; Lindner M. et al, 2011). В нашей стране подобные исследования только начались.

Практически все заболевания, выявляемые методом МС/МС, требуют проведения довольно разнообразных дополнительных тестов с целью их подтверждающей диагностики. Хотя для большинства НБО в качестве основных подтверждающих тестов применяются биохимические методы, для некоторых заболеваний требуется проведение ДНК-диагностики, прежде всего это касается нарушений митохондриального -окисления.

Так как в Российской Федерации все в большем числе центров появляется возможность применения МС/МС анализа для выявления НБО, а в некоторых регионах планируется внедрение данного метода в программы массового скрининга новорожденных, необходима предварительная работа по определению методов, необходимых для дополнительного обследования и разработка оптимальных подходов к подтверждению диагноза.

В связи с этим разработка алгоритмов диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов, является актуальной задачей, что определило цель настоящей работы.

Цель работы: разработка алгоритмов диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов.

1. Изучить особенности спектра аминокислот и ацилкарнитинов в различных возрастных группах в контрольной выборке.
2. Определить спектр и относительную частоту патологий, относящихся к данным группам наследственных болезней обмена, при селективном скрининге в отделениях психоневрологии, гепатологии и патологии раннего детского возраста.
3. Охарактеризовать спектр мутаций при наиболее частых наследственных болезнях обмена, выявленных в ходе селективного скрининга и разработать простые ДНК-тесты для выявления наиболее распространенных мутаций.
4. Составить алгоритмы подтверждающей диагностики для наследственных болезней обмена, выявляемых методом тандемной масс-спектрометрии.
5. Оценить частоту наиболее распространенных заболеваний из группы нарушений митохондриального -окисления среди новорожденных г.Москвы.

В результате исследования впервые в России определен спектр патологий, относящихся к группе аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального -окисления у различных контингентов больных, а также определены референсные уровни 52 метаболитов в разных возрастных группах.

Для повышения чувствительности диагностики дефектов окисления жирных кислот выведены новые, диагностически значимые, соотношения при недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси- ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот.

В ходе работы впервые определены спектры мутаций при тирозинемии тип 1, недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси- ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот, недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот и глутаровой ацидурии тип 1. Для этих заболеваний у Российских пациентов определены частые мутации и разработаны простые методы ПЦР-ПДРФ анализа для их детекции.

Впервые идентифицированы мутации в генах BCKDHA и BCKDHB (лейциноз), OTC (недостаточность орнитинтранскарбамилазы), MUT и MMAA (метилмалоновая ацидурия), ACAT1 (недостаточность митохондриальной ацетоацетил-КоА тиолазы) и ACADVL (недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот) у Российских пациентов.

Составлена дифференциально-диагностическая таблица, в которой приведены основные этапы подтверждающей диагностики и рекомендации по интерпретации полученных данных.

На основе определенных прямыми методами популяционной и относительной частот мутаций Lys304Glu и Glu474Gln впервые дана оценка частот недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот (СЦАД) и недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси- ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот (ДЦГАД) среди новорожденных г.Москвы.

В ходе работы проанализировано более 8000 образцов индивидуумов, что позволило получить довольно точные количественные характеристики многих параметров, а также получить новые, диагностически значимые, соотношения, которые можно включить в программы скрининга с использованием МС/МС анализа.

Заболевания данной группы НБО не распознаются или поздно диагностируются в практике отечественной педиатрии и особенно, неонаталогии. Многие из этих заболеваний могут эффективно коррегироваться, поэтому разработка подходов к их дифференциальной диагностике является актуальной задачей, имеющей большое практическое значение. Поскольку данное исследование адресовано, прежде всего, врачам-лаборантам и врачам-генетикам, работающим в медико-генетической службе, которые не имеют пока большого опыта в диагностике этих форм НБО, в ходе работы составлена дифференциально-диагностическая таблица, в которых приведены основные этапы подтверждающей диагностики и рекомендации по интерпретации полученных данных.

Выявленные особенности в спектре нозологических форм среди пациентов из разных отделений стационаров позволяют более рационально планировать тактику дифференциальной диагностики и улучшить выявление редких НБО среди данного контингента больных. Алгоритмы подтверждающей диагностики, а также референсные значения метаболитов и их соотношений могут применяться не только для селективного скрининга, но некоторые из них могут быть взяты за основу при подготовке к проведению массового скрининга новорожденных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Концентрации исследуемых с помощью тандемной масс-спектрометрии метаболитов имеют существенные различия в разных возрастных группах.

2. Выведенные новые соотношения метаболитов для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность тандемной масс-спектрометрии для диагностики этих заболеваний.

3. Составлены алгоритмы подтверждающей диагностики для всех выявленных форм наследственных болезней обмена.

4. Охарактеризован спектр мутаций при тирозинемии тип 1, глутаровой ацидурии тип 1, лейцинозе, недостаточности орнитинтранскарбамилазы, метилмалоновой ацидурии, недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы.

5. Оценка частот недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы среди новорожденных г.Москвы показала, что частота недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы выше, а частота среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы гораздо ниже, чем в большинстве стран Западной Европы

Материалы исследования доложены на ежегодных конференциях Общества по изучению наследственных болезней обмена веществ в 2004, 2007, 2008, 2010 и 2011 гг. ежегодной конференции Европейского общества генетики человека в 2005 г. V съезде Российского общества медицинских генетиков в 2005 г. (г.Уфа), Национальном конгресса «Неотложные состояния в неврологии» в 2009 г. (г.Москва), VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону).

Личный вклад автора.

Автором лично проведен количественный анализ метаболитов, измеряемых с помощью МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС, определение активности биотинидазы. Составлена дифференциально-диагностическая таблица, в которых приведены основные этапы подтверждающей диагностики и рекомендации по интерпретации полученных данных. Этапы молекулярно-генетического анализа, включающие: экстракцию геномной ДНК, дизайн праймеров, подбор условий и проведение полимеразной цепной реакции изучаемых участков генома выполнены лично.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 242 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами и 32 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 213 ссылок, и 5 приложений.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В период с января 2004 по ноябрь 2011 года обследовано 8615 пациентов в возрасте от 1 дня до 30 лет, среди них 4820 (56%) – пациенты мужского пола и 3795 (44%) – женского. Для анализа использована капиллярная или венозная кровь, собранная на стандартную карточку-фильтр № 903. Высушенные образцы крови хранились при +40С.

Анализ аминокислот и ацилкарнитинов проводился с помощью набора «NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit» (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland) на квадрупольном тандемном масс-спектрометре PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Онтарио, Канада) с положительной ионизацией в электроспрее. Значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов рассчитывались автоматически с применением внутренних стандартов с помощью программы NeoGram (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland).

ВЭЖХ-МС/МС органических кислот мочи

Анализ концентраций сукцинилацетона, глутаровой и оротовой кислот в моче проводили на хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США), на колонке 100Х2,1 мм 5 мкм «Hypersil GOLD C18» (Thermo scientific, США) с детектированием на квадрупольном тандемном масс-спектрометре AB Sciex API 3200 QTrap (AB Sciex, США) с ионизацией в электроспрее методом построения калибровочной кривой. Состав и скорость растворителей, а также условия детектирования подбирались экспериментально.

Газовая хроматография–масс-спектрометрия органических кислот мочи.

Газовая хроматография – масс-спектрометрия выполнена на приборе 7890А/5975С (Agilent Technologies, США), колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определялась в виде триметилсилиловых эфиров. Расчет полученных результатов осуществлялся методом внутреннего стандарта.

Определение активности биотинидазы

Активность биотинидазы определялась в сыворотке крови колориметрическим методом на спектрофотометре Spectronic Genesys 5 (Thermo Spectronic Instruments, США) при 550 нм (Wolf B. et al, 1983).

Молекулярно-генетические методы исследования.

Геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Полимеразную цепную реакцию, рестрикционный анализ и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook J. et al. 1989). Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига праймеров и концентрацией MgCl2. Для анализа частых мутаций использованы эндонуклеазы рестрикции MspI, Bsp19I, PstI, AcuI, Bsp1720I и Tru 9I («СибЭнзим», Россия). Секвенирование ПЦР-фрагментов с целью выявления редких мутаций проведено согласно протоколу фирмы производителя на приборах ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) (Лаборатория ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН, Заведующий – д.б.н. Поляков А.В.) и ABI Prism 3500 (Applied Biosystems).

Методы статистического анализа.

Оценку статистической значимости результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям «нормальности». В случае нормального распределения применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае – критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica for Windows 6.0.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнение разных возрастных групп

Согласно критериям развития ребенка, принятыми в педиатрии (Педиатрия, национальное руководство, 2009) контрольная выборка для определения референсных границ (n=3572) разделена на восемь возрастных групп и проведено исследование 20 аминокислот и 32 ацилкарнитинов:

1 группа – новорожденные (по 7 день жизни, n=441),

2 группа – неонатальный период (до 1 месяца, n=165),

3 группа – грудное вскармливание (от 1 до 6 месяцев, n=386),

4 группа – ввод прикорма (от 6 месяцев до 1 года, n=547),

5 группа – раннее детство (от 1 до 3 лет, n=713),

6 группа – дошкольный период (от 3 до 7 лет, n=687),

7 группа – младший школьный период (от 7 до 12 лет, n=451),

8 группа – подростковый период (от 12 до 16 лет, n=182).

Оценка межгрупповых различий с использованием критерия Ньюмана-Кейлса показала, что по некоторым исследуемым метаболитам возрастные группы достоверно отличаются друг от друга (р<0,01). Наибольшие различия при количественном анализе аминокислот наблюдаются в группе новорожденных по сравнению с другими группами. Так в этой группе концентрация незаменимых аминокислот (лейцин, метионин, фенилаланин, валин) достоверно выше, а аминокислоты, участвующие в цикле мочевины, достоверно снижены (орнитин, цитруллин, аргинин, аспарагиновая кислота) по сравнению с другими группами.

С целью решения вопроса о необходимости применения разных референсных значений для разного пола, была проведена оценка исследуемых групп с помощью критерия Манна-Уитни, которая не показала достоверных отличий по полу ни в общей выборке, ни в каждой возрастной группе отдельно.

Поскольку при анализе межгрупповых различий не выявилось достоверных различий между группами по многим исследуемым параметрам, проведен классический кластерный анализ К-средних и иерархический кластерный анализ (рис.1.), которые позволили перегруппировать исследуемую выборку на 3 группы:

Группа 1 – новорожденные (n=441)

Группа 2 – дети от 8 дней до 6 месяцев жизни (n=551)

Группа 3 – от 6 месяцев и старше (n=2580).

Дальнейшие этапы исследования проведены в вышеперечисленных трех возрастных группах.

Таким образом, проведенный анализ позволяет сделать следующее заключение – измеряемые метаболиты имеют возрастные особенности, поэтому при определении референсных значений следует это учитывать, что имеет важное значение при проведении селективного скрининга на НБО.

3.2. Определение референсных значений

Поскольку в России впервые применялся МС/МС анализ для выявления аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального -окисления в первую очередь стояла задача определить референсные значения измеряемых метаболитов.

Рис.1. Иерархическая классификация для 8 возрастных групп.

Для всей выборки кроме новорожденных не применялся принцип безотборного формирования. Для НБО такой подход вполне оправдан, поскольку при большинстве из них наблюдаются значительные изменения в концентрациях одного или нескольких метаболитов, в десятки раз, превышающие нормальные значения. Такой принцип формирования референсных значений принят в стандартной лабораторной практике, когда в качестве референсных значений лабораторных показателей наиболее часто используют границы, найденные методом персентилей (Гланц С. 1998). Разные авторы применяют различные методы определения референсных границ, чаще всего 99,5% (0,5%) персентиль (Rashed M.S. et al, 1997; Schulze A. et al, 2003; Wilcken B. et al. 2001), иногда значение концентраций соответствующих среднему значение плюс 4 или 5 стандартных отклонений (Hoffman G. et al. 2001; Zytkovicz T.H. et al. 2001).

В данном исследовании в качестве возрастных референсных границ использован наиболее принятый метод оценки значений концентраций метаболитов, соответствующие 0,5% и 99,5% персентилям.

3.3. Спектр аминокислот и ацилкарнитинов при патологии.

Всего с января 2004 по октябрь 2011 года обследовано 8615 пациентов. Среди них новорожденных – 519, детей в возрасте от 8 дней до 6 месяцев – 1663, старше 6 месяцев – 6433. Подавляющее число пациентов поступило из отделений психоневрологии – 6091 (71%), меньше из отделений гастроэнтерологии/инфекций – 2005 (23%) и только 6% пациентов (519 человек) поступило из отделений патологии новорожденных.

У 357 пациентов (4% от общего числа) выявлено отклонение в концентрациях измеренных метаболитов. Большинство изменений выявлены в спектре ацилкарнитинов – 59,4%, меньше среди аминокислот – 31,5%, в 9,1% случаев изменения наблюдались в спектре как аминокислот, так и ацилкарнитинов. Среди изменений спектра аминокислот следует отметить повышение концентрации аланина, что обнаружено у пациентов с лактат-ацидозом (n=32), и повышение тирозина и/или метионина, которое выявлено у 123 больных с поражением печени разной этиологии.

Высокий процент ложноположительных результатов при анализе ацилкарнитинов, безусловно связан с особенностями обследованного контингента пациентов – практически все они получают терапию, в том числе лекарственные средства, которые при МС/МС анализе могут образовывать пики с m/z, сходным с m/z диагностически значимых ацилкарнитиинов, как например, препараты вальпроевой кислоты, витамины, жировые эмульсии и т.д. (Moreno F.A. et al, 2005).

После проведения дополнительных исследований, которые включали определение концентрации ацилкарнитинов в плазме крови, определение органических кислот мочи методом ГХ/МС, исследование активности ферментов и ДНК-диагностики диагноз НБО был подтвержден у 139 пациентов, что составило 39% от общего числа пациентов с выявленными изменениями в спектре аминокислот и ацилкарнитинов и 1,6% от общей выборки пациентов. Из них у 57 (в том числе ФКУ – 23) выявлены нарушения обмена аминокислот (АА), у 56 – органические ацидурии (ОА), у 26 – дефекты окисления жирных кислот (ДОЖК).

При сравнении результатов селективного скрининга (рис.2.) можно отметить следующие особенности: среди пациентов из отделений патологии новорожденных превалировали аминоацидопатии с ранним началом и острым течением из группы нарушений цикла мочевины.

Рис.2. Спектр патологий среди пациентов из отделений разного профиля.

Подавляющее большинство пациентов с ОА из отделений гастроэнтерологии и инфекции составляли пациенты с метилмалоновой ацидурией (ММА), в то время как все пациенты с глутаровой ацидурией тип 1 (ГА1) и недостаточностью биотинидазы (НБ) поступили из отделений психоневрологии (рис.3.). Среди пациентов с ДОЖК, поступивших из отделений гастроэнтерологии и инфекции 69% составили пациенты с недостаточностью ДЦГАД (рис.4.).

Рис.3. Спектр органических ацидурий среди пациентов из отделений разного профиля.

Рис.4. Спектр нарушений митохондриального -окисления среди пациентов из отделений гастроэнтерологии и инфекции.

3.3.1. Нарушения обмена аминокислот

Методом МС/МС возможно определять более 20 различных аминокислот, изменение концентрации которых является маркером разных форм аминоацидопатий – тирозинемии, нарушений цикла мочевины, лейциноза, ФКУ, гомоцистинурии. Следует отметить, что далеко не во всех случаях измерение концентрации аминокислот достаточно для точного установления диагноза. Определение отрезной точки (cut-off) для каждого анализируемого соединения всегда является определенным компромиссом между высокой чувствительностью и поддержанием ложно-отрицательных результатов на низком уровне.

Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 1. Концентрации этих метаболитов статистически достоверно отличается от контрольной выборки и согласуется с данными литературы. Поскольку число выявленных случаев было невелико, провести другую дополнительную оценку значений показателей не представлялось возможным.

3.3.2. Органические ацидурии

Довольно большое число заболеваний, связанных с повышением уровня органических кислот (органические ацидурии) возможно диагностировать с помощью МС/МС анализа. Метилмалоновая, пропионовая и изовалериановая ацидурии имеют характерные изменения при МС/МС. При глутаровой ацидурии глутарилкарнитин (C5DC), может иметь пограничные значения, особенно если образцы взяты у ребенка в возрасте 7 и более дней.

Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 2.

Таблица 1. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе аминоацидопатий

Анализ ацилкарнитинов и их соотношений позволяет выявлять заболевания, относящиеся к нарушению самого процесса -окисления, транспорта карнитина и карнитинового цикла. Для некоторых заболеваний из этой группы массовый скрининг выявляет случаи при которых у индивидуума с положительными результатами никогда в течении всей жизни не наблюдаются эпизодов метаболической декомпенсации и каких-либо клинических проявлений. Наиболее показательным примером этих случаев является одно из самых частых нарушений -окисления – недостаточность СЦАД, частота которой увеличилась почти в два раза после введения скрининга с помощью МС/МС на это заболевание.

Средняя частота нарушений митохондриального -окисления по данным литературы убывает в следующем порядке: СЦАД КЦАД ОДЦАД ДЦГАД. Довольно интересно, что самое редкое заболевание из этой группы по данным литературы, при селективном скрининге в нашем исследовании оказалось одним из наиболее частых. Можно предложить несколько объяснений, во-первых, что это заболевание действительно встречается чаще, во-вторых, что это связано с особенностями формирования контингента больных на исследование (это в основном дети, имеющие острые метаболические нарушения). Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 3.

3.4. Анализ соотношений метаболитов

МС/МС анализ не всегда позволяет однозначно подтвердить диагноз. При некоторых заболеваниях могут повышаться одни и те же метаболиты (ММА и ПА). Кроме того, в ряде случаев значения метаболитов могут иметь пограничные значения. Также некоторые метаболиты могут повышаться вторично, как, например, аланин при лактат-ацидозе или тирозин при нарушениях функции печени различной этиологии.

Таблица 3. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе нарушений митохондриального -окисления.

Референсные значения, мкМ/Л

Поэтому кроме референсных значений, для повышения достоверности результатов диагностики довольно часто прибегают к оценке соотношений различных параметров. В литературе такие соотношения были установлены для ФКУ (Chace D.H. et al. 1998), недостаточности карнитин пальмитоил трансферазы тип 1 (Fingerhut R. et al. 2001) и некоторых других заболеваний. Низкая концентрация свободного карнитина, пул которого истощается вторично при многих из нарушений обмена жирных кислот, в ряде случаев не дает возможность определить точный спектр измененных ацилкарнитинов, поэтому поиск значимых соотношений представляет собой несомненную прогностическую ценность.

3.4.1. Недостаточность ДЦГАД.

В ходе исследования выявлено, что у пациентов с недостаточностью ДЦГАД достоверно повышены концентрации длинноцепочечных 3-гидрокси ацилкарнитинов, кроме того, у 40% обследованных пациентов был снижен свободный карнитин и как следствие концентрация всех ацилкарнитинов. С учетом этих особенностей выведено новое соотношение (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0, которое позволяет повысить не только чувствительность, специфичность, но и положительную прогностическую ценность (таблица 4).

Таблица 4. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность маркеров ДЦГАД.

Узнайте, что такое Саентология.

Ваша жизнь поменяется.

*. ИО – истинноотрицательные, ЛО – ложноотрицательные, ИП – истинноположительные, ЛП – ложноположительные, ППЦ – положительная прогностическая ценность.

При применении в качестве маркеров только концентраций длинноцепочечных 3-гидрокси-ацилкарнитинов следует особое внимание уделять концентрации свободного карнитина, снижение которого может приводить к снижению концентраций и этих метаболитов, снижая чувствительность и специфичность данных маркеров (таблица 4).

3.4.2. Недостаточность СЦАД

В ходе исследования выявлено, что у пациентов с недостаточностью СЦАД достоверно повышены концентрации среднецепочечных ацилкарнитинов (С8, С6, С10 и С10:1). Также найдено, что у этих пациентов снижаются концентрации некоторых длинноцепочечных ацилкарнитинов (С16, С18, С18:1). С биохимической точки зрения это, вероятно, связано с тем, что пул длинноцепочечных ацилкарнитинов истощается, за счет повышения активности митохондриального -окисления жирных кислот, ферменты которого регулируется различными промежуточными и конечными метаболитами, например, повышение соотношения NADH/NAD+ и ацетил-КoA/КoA приводит к подавлению -окисления жирных кислот, снижение, наоборот, к повышению активности ферментов, участвующих в этом метаболическом процессе. На основании полученных данных выведено соотношение: (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1), повышающее чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность анализа (таблица 5).

Таблица 5. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность маркеров СЦАД.

*. ИО – истинноотрицательные, ЛО – ложноотрицательные, ИП – истинноположительные, ЛП – ложноположительные, ППЦ – положительная прогностическая ценность.

Использование в качестве диагностических маркеров только значения концентраций среднецепочечных ацилкарнитинов (С6, С8, С10, С10:1) может давать ложноположительные результаты, в то время, как использование выведенного соотношения снижает их число.

Из таблиц 4 и 5 следует, что наибольшей чувствительностью и специфичностью обладают именно соотношения, а не измеряемые метаболиты, что говорит о необходимости включения диагностически значимых соотношений в программы скрининга с использованием МС/МС анализа.

Выведенные соотношения для ДЦГАД и СЦАД не упоминаются в литературе, однако несмотря на небольшие выборки пациентов их информативность не вызывает сомнений и в случае получения пограничных значений основных маркеров, позволит избежать ложноотрицательных и ложноотрицательных результатов.

3.5. Подтверждающая диагностика

В рамках данного исследования дополнительно разработаны некоторые методы подтверждающей диагностики.

3.5.1. Определение активности биотинидазы

Активность биотинидазы в сыворотке крови определена у 18 пациентов и в 114 контрольных образцах. Диагноз недостаточность биотинидазы (НБ) установлен на основании клинических проявлений, а также подтвержден молекулярно-генетическими методами. В таблице 6 представлены средние значения активности фермента для пациентов с установленным диагнозом НБ и контрольной группы. Статистически достоверные (по критерию Ньюмена-Кейлса, уровень значимости р<0.05 ) различия между средними значениями активности фермента позволяют применять данный метод для подтверждающей биохимической диагностики НБ.

3.5.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография–тандемная масс-спектрометрия.

Для дифференциальной диагностики тирозинемии тип 1, нарушений цикла мочевины и глутаровой ацидурии тип 1 разработаны методы определения сукцинилацетона, оротовой и глутаровой кислот в моче с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа (таблица 7). Методы, обладают высокой чувствительностью, большим диапазоном линейности и позволяют проводить исследование образцов мочи, собранных на карточку фильтр, что дает возможность упростить их транспортировку из удаленных регионов РФ в лабораторию.

Таблица 6. Итоговая таблица средних значений активности биотинидазы.

3.5.3. Газовая хроматография/масс-спектрометрия органических кислот мочи.

Подтверждающая диагностика большинства заболеваний из групп органических ацидурий и аминоацидопатий проведена с применением газовой хроматографии – масс-спетрометрии (ГХ/МС). Всем пациентам, у которых выявлены соответствующие изменения в спектре аминокислот и ацилкарнитинов, проведено данное исследование. Существенное повышение концентраций определенных органических кислот и ацилглицинов являлось основанием для окончательного подтверждения диагноза (таблица 8).

3.6. Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний, выявленных в ходе исследования.

Хотя для большинства НБО в качестве основных подтверждающих тестов применяются биохимические методы, для некоторых заболеваний требуется проведение ДНК-диагностики. Особенно это актуально для нарушений окисления жирных кислот. Кроме того данные исследования необходимы в тех случаях, когда семья планирует проведение пренатальной диагностики. Также характеристика спектра мутаций при разных заболеваниях имеет самостоятельное научное значение, поскольку расширяет наши представления о генетическом многообразии и наши данные об особенностях разных популяций.

В ходе исследования разработаны простые и быстрые методы ДНК-диагностики для выявления частых мутаций при глутаровой ацидурии тип1, тирозинемии тип 1, недостаточности СЦАД и ДЦГАД (таблица 9).

Таблица 8. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе органических ацидурий.

Таблица 9. Частые мутации для некоторых заболеваний.

Глутаровая ацидемия тип 1

Несмотря на небольшой размер выборок, расширены представления о спектре мутаций для некоторых заболеваний, выявленных в ходе исследования (рисунок 5). Всего в ходе исследования разработаны методы ДНК-диагностики для 12 заболеваний из этой группы (таблица 10), выявлено 24 новых мутаций и 33 описанных ранее в литературе.

а) тирозинемия тип 1 б) глутаровая ацидурия тип 1

Рис.5. Спектр мутаций у пациентов.

Таблица 10. Заболевания, для которых в ходе исследования разработаны методы ДНК-диагностики.

Глутаровая ацидурия тип 1

3.7. Частота длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот.

Поскольку в ходе исследования из 26 пациентов c ДОЖК, 15 пациентов было с недостаточностью ДЦГАД и только 5 с недостаточностью СЦАД, а по данным литературы недостаточность СЦАД является самым частым заболеванием из группы ДОЖК, и среди пациентов с недостаточностью ДЦГАД и СЦАД с высокой частотой встретились мутации Glu474Gln и Lys304Glu (83,3 % и 70%, соответственно), проведено определение частоты данных мутаций методом ПЦР-ПДРФ анализа среди новорожденных г. Москвы. На основании анализа частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы выявлено, что частота СЦАД в России значительно ниже, чем во многих других странах Западной Европы, а частота ДЦГАД сравнима с частотами некоторых стран Западной Европы (таблица 11).

Таблица 11. Анализ частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы.

Относительная доля мутации

Частота заболевания в Европейских странах

1/100 000 – 1/300 000

1/6 000 – 1/42 300

Тандемная масс-спектрометрия – новая перспективная технология просеивающих программ на НБО, которая уже многие годы широко применяется во многих странах мира. Далеко не все заболевания, выявляемые методом МС/МС, подходят под критерии, которые разработаны для неонатального скрининга. Некоторые из них относятся к числу чрезвычайно редких, другие не поддаются эффективному лечению, для ряда заболеваний не показана высокая чувствительность метода, что не позволяет избежать ложно-отрицательных результатов скринирования. Кроме того, большое число разнообразных заболеваний, на которые проводится исследование, значительно усложняет процедуру подтверждающей диагностики. Подтверждающие тесты, которые применяются для этих групп болезней, включают: дополнительное определение различных метаболитов методом ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС, определение активности ферментов, молекулярно-генетическое тестирование.

При всем этом преимущества данной технологии неоспоримы – без дополнительных временных и финансовых затрат проводится одновременное определение нескольких десятков разных метаболитов, характеризующих около 35 разных НБО, диагноз некоторых из них на ранней стадии болезни дает возможность начать лечение и предотвратить тяжелые последствия для жизни и здоровья пациента. Поэтому вопрос о включении новых заболеваний в программу массового скрининга сложный, требующий отдельной проработки и соответствующих решений. Но для программ селективного скрининга данный метод может уже сейчас применяться и довольно успешно.

В Российской Федерации все в большем числе центров появилась возможность применения этого метода для выявления НБО и проведения биохимического контроля за диетотерапией. Именно поэтому, одной из основных задач данного исследования являлась оптимизация проведения обследования на НБО (селективного скрининга) методом МС/МС. В ходе проведенного исследования получены собственные данные по количественным характеристикам аминокислот и ацилкарнитинов в норме, впервые в практике отечественной медицины лабораторно подтверждены некоторые редкие формы НБО (недостаточность митохондриальной кетотиолазы). В ходе реализации работы проанализировано более 8000 индивидуумов, что позволило получить довольно точные количественные характеристики многих параметров, а также получить новые, диагностически значимые, соотношения, которые можно включить в программы скрининга с использованием МС/МС анализа.

Большое внимание в работе уделено методам подтверждающей диагностики этих заболеваний. В рамках данного исследования дополнительно разработаны методы подтверждающей биохимической диагностики: нарушений цикла мочевины (определение оротовой кислоты в моче), глутаровой ацидурии тип 1 (определение глутаровой кислоты в моче), определение активности биотинидазы в плазме/сыворотке крови, разработаны простые и быстрые методы ДНК-диагностики для выявления частых мутаций при глутаровой ацидурии тип1, тирозинемии тип 1, недостаточности СЦАД и ДЦГАД.

Отдельным направлением работы явилась молекулярно-генетическая характеристика заболеваний, выявленных у наибольшего числа пациентов. Несмотря на небольшой размер выборок расширены представления о спектре мутаций при метилмалоновой ацидурии, тирозинемии тип 1, лейцинозе, недостаточности орнитинтранскарбамилазы. Выявлено 24 новых мутаций и 33 описанных ранее в литературе. Данные молекулярно-генетического исследования имеют большое значение для отягощенных семей, поскольку для проведения пренатальной диагностики, ДНК-исследование является наиболее предпочтительным.

На основании анализа частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы выявлено, что частота СЦАД в России значительно ниже, чем во многих других странах Западной Европы, а частота ДЦГАД сравнима с частотами некоторых стран Западной Европы.

Для нескольких пациентов со сходной характеристикой метаболитов и клинических проявлений проведен поиск мутаций в одном из генов-кандидатов ACAD9, выбранный исходя из предположительного биохимического дефекта. Патогенных мутаций в гене не выявлено, что позволяет исключить его как возможный ген-кандидат при данном нарушении метаболизма длинноцепочечных ацилкарнитинов. Однако, не вызывает сомнений, что некоторые новые формы НБО еще могут быть открыты после более широкого применения МС/МС и тщательного анализа результатов.

Безусловная редкость заболеваний из этой группы НБО не позволяет провести исследования, позволяющие охарактеризовать все варианты НБО из этой группы, разработать статистически обоснованный подход к диагностике всех заболеваний. Большинство рекомендаций по диагностике этой патологии могут быть даны только на основании обобщения данных литературы и собственного опыта. Поскольку данное исследование адресовано, прежде всего, врачам-лаборантам и врачам-генетикам, работающим в медико-генетической службе, которые не имеют пока большого опыта в диагностике этих форм НБО, составлены дифференциально-диагностические таблицы, в которых приведены основные этапы подтверждающей диагностики и рекомендации по интерпретации полученных данных. Разработанные в ходе исследования подходы могут применяться не только для селективного скрининга, но некоторые из них могут быть взяты за основу при подготовке к проведению массового скрининга новорожденных.

1. На основании анализа концентрации аминокислот и ацилкарнитинов в трех возрастных группах выявлено, что имеются существенные межгрупповые различия, поэтому при селективном скрининге на наследственные болезни обмена требуется определение референсных значений для разных возрастных групп.

2. В ходе обследования 8615 пациентов, направленных с предположительным диагнозом наследственные болезни обмена, выявлено 139 (1,6%) пациентов: из них с аминоацидопатиями (в том числе 23 пациента с фенилкетонурией) – 57 пациентов (41%), с органическими ацидуриями – 56 (40%), с дефектами митохондриального -окисления – 26 (19%). Низкий процент выявленных пациентов указывает на необходимость разработки более четких показаний к селективному скринингу на наследственные болезни обмена данным методом.

3. Анализ соотношений метаболитов позволил определить новые диагностические значимые соотношения для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы, (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода тандемной масс-спектрометрии для диагностики этих заболеваний.

4. Составлены алгоритмы подтверждающей диагностики для 18 выявленных в ходе исследования форм наследственных болезней обмена, включающие ДНК-диагностику и высокочувствительные методы определения сукцинилацетона, оротовой и глутаровой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии – тандемной масс-спектрометрии.

5. При тирозинемии тип 1, глутаровой ацидурии тип 1, недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы выявлены частые мутации (IVS 6-1 G>T, IVS 12+5 G>A, Pro342Leu; Arg402Trp; Glu474Gln; Lys304Glu, соответственно) и разработаны простые, быстрые методы их детекции (ПЦР-ПДРФ анализ). Обнаружены новые мутации: 1 – при тирозинемии тип 1; 7 – при лейцинозе; 6 – при метилмалоновой ацидурии; 2 – при глутаровой ацидурии тип 1; 5 – при недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы и 1 мутация de novo при недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

6. Оценка частот недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот и длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот среди новорожденных г.Москвы, рассчитанных из популяционных частот мутации Lys304Glu (0,00126 (0,00000/0,00301, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,70) и Glu474Gln (0,00346 (0,00043/0,00649, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,833) составила 1/279947 и 1/57784, соответственно. Полученная частота длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот выше, а частота среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот гораздо ниже, чем в большинстве стран Западной Европы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Байдакова Г.В.. Букина А.М. Гончаров В.М. Шехтер О.В. Букина Т.М. Покровская А.Я. Захарова Е.Ю. Михайлова С.В. Федонюк И.Д. Колпакчи Л.М. Семыкина Л.И. Ильина Е.С. Диагностика наследственных болезней обмена веществ на основе сочетания методов тандемной масс-спектрометрии и энзимодиагностики.// Медицинская генетика. – 2005. – Т.4, № 1. – С.28-33.
2. Михайлова С.В. Ильина Е.С. Захарова Е.Ю. Байдакова Г.В.. Бембеева Р.Ц. Шехтер О.В. Захаров С.Ф. Множественная карбоксилазная недостаточность, обусловленная мутациями в гене биотинидазы. // Медицинская генетика. – 2005. – № 2. – C.633-638.
3. Михайлова С.В. Захарова Е.Ю. Бобылова М.Ю. Рассказчикова И.В. Ильина Е.С. Байдакова Г.В.. Шехтер О.В. Банин А.В. Брюсова И.Б. Волкова Г.И. Петрухин А.С. Глутаровая ацидурия тип 1: клиника, диагностика и лечение.// Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2007. – Т.107, №10. – С.4-12.
4. Николаева Е.А. Цыганкова П.Г. Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю. Белоусова Е.Д. Шулякова И.В. Симптоматическая эпилепсия как проявление дефицита ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот с очень длинной углеродной цепью.// Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2008. – №3. – С.87-91.
5. Панкратова, Е.В. Воскобоева Е.Ю. Байдакова Г.В.. Захарова Е.Ю. Создание тест-системы для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и -1-антитрипсина.// Медицинская генетика. – 2010. – №3. – С.34-42.
6. Горбань Т.С. Дегтярева М.В. Бабак О.А. Воронцова Ю.Н. Захарова Е.Ю. Байдакова Г.В.. Володин Н.Н. Динамика концентрации карнитина в сыворотке крови у детей с очень низкой массой тела при рождении.// Вопросы практической педиатрии. – 2011. – Т.6, №4. – С.28-32.

Публикации в других изданиях:

1. Захарова Е.Ю. Ильина Е.С. Букина А.М. Букина Т.М. Захаров С.Ф. Михайлова С.В. Федонюк И.Д. Байдакова Г.В.. Семыкина Л.И. Колпакчи Л.М. Зайцева М.Н. Результаты проведения селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ среди пациентов психоневрологических отделений.// Второй Всероссийский Конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». – Материалы Конгресса. – 2003. – C.141-142.
2. Mikhaylova S.V. Baydakova G.V.. Boukina A.M. Boukina T.M. Shechter O.V. Ilina E.S. Zakharova E.Y. Combination of tandem mass spectrometry and lysosomal enzymes analysis-effective tool for selective screening for IEM in neurological clinic.// J. Inherit Metab. Dis. – 2004. – V.27, S.1. – P.3.
3. Mikhaylova S.V. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. Il’ina E.S. «First cases of biotinidase deficiency in Russia» //European Journal of Human Genetics. – 2005. – V.13, S.1. – P.386.
4. Захарова Е.Ю. Байдакова Г.В.. Шехтер О.В. Ильина Е.С. Михайлова С.В. Тандемная масс-спектрометрия – новый подход диагностики наследственных нарушений обмена веществ // V съезд Российского общества медицинских генетиков. – Медицинская генетика. – 2005. – Т.4, № 4. – С.188.
5. Mikhaylova S.V. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. Shehter O.V. Ilina E.S. Clinical outcome of glutaric aciduria type I in Russia.// J. Inherit Metab. Dis. – 2007. – V.30, S.1. – P.38.
6. Baydakova G.V.. Tsygankova P.G. Diagnosis of mitochondrial -oxidation defects in Russia. // J. Inherit Metab. Dis. – 2008. – V.31, S.1. – P.39.
7. Михайлова С.В. Захарова Е.Ю. Ильина Е.С. Колпакчи Л.М. Букина А.М. Федонюк И.Д. Байдакова Г.В., Холин А.А. Эпилепсия при наследственных болезнях обмена веществ.// Материалы Национального конгресса «Неотложные состояния в неврологии». – 2009. – С.362.
8. Shekhter O.V. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. Methylmalonic aciduria in Russia.// J. Inherit Metab. Dis. – 2010. – V.33, S.1. – P.55.
9. Baydakova G.V., Zakharova E.Y. Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency – the most frequent fatty acid oxidation disorder in selective screening in Russia. // J. Inherit Metab. Dis. – 2010. – V.33, S.1. – P.63.
10. Mikhaylova S.V. Mathina I.A. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. Bologov A.A. Ornitine transcarbamylase deficiency in a girl - case report.// J. Inherit Metab. Dis. – 2010. – V.33, S.1. – P.121.
11. Шехтер О.В. Байдакова Г.В.. Захарова Е.Ю. Лабораторная диагностика метилмалоновой ацидемии.// VI съезд Российского общества медицинских генетиков. – Медицинская генетика. – 2010. – С.195.
12. Байдакова Г.В.. Захарова Е.Ю. Недостаточность длинноцепочечной 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот - частая в России форма дефектов митохондриального бета-окисления. // VI съезд Российского общества медицинских генетиков. – Медицинская генетика. – 2010. – С.16.
13. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. Osavchuk E.A. LCHADD versus MCADD in Russia.// J. Inherit Metab. Dis. – 2011. – V.34, S.3. – P.153.
14. Pichkur N.O. Olkhovych N.V. Gorovenko N.G. Zakharova E.Yu. Baydakova G.V. A case of the tyrosinemia type I in Ukraine: experience and outcome.// J. Inherit Metab. Dis. – 2011. – V.34, S.3. – P.81.
15. Mikhaylova S.V. Baydakova G.V.. Zakharova E.Y. High single mutation frequency for biotinidase deficiency in Russia.// J. Inherit Metab. Dis. – 2011. – V.34, S.3. – P.122.
16. Захарова Е.Ю, Воскобоева Е.Ю. Байдакова Г.В.. Шехтер О.В. Букина Т.М. Букина А.М. Наследственные болезни обмена веществ.// Клиническая лабораторная диагностика: Национальное руководство. В 2-х томах. – Москва. – «ГЭОТАР-Медиа». – 2012. – С.719.

ВЭЖХ-МС/МС – высокоэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия

ГА1 – глутаровая ацидурия тип 1

ГХ/МС – газовая хроматография – масс-спектрометрия

ДОЖК – дефекты окисления жирных кислот

ДЦГАД – длинноцепочечная 3-гидрокси- ацил-КоА дегидрогеназа

КЦАД – короткоцепочечная ацил-КоА дегидрогеназа

ММА – метилмалоновая ацидурия

МС/МС – тандемная масс-спектрометрия

НБ – недостаточность биотинидазы