ТУБЕРКУЛИН - это

ТУБЕРКУЛИН — получен Кохом в 1891 г. Этот первый препарат носит название старого ко ховского Т. (ТАК). Пропись Коха для приготовления ТАК следующая: 4 6 недельные культуры туб. бацил на 5% ном глицериновом бульоне стерилизуются в текучем пару 1 час и затем… … Большая медицинская энциклопедия

ТУБЕРКУЛИН — Жидкость, изобретенная нем. врачом Кохом, как средство против чахотки, бугорчатки. Словарь иностранных слов, вошедших в состав русского языка. Чудинов А.Н. 1910. ТУБЕРКУЛИН жидкость, изобретенная Р. Кохом и предложенная им в качестве лечебного… … Словарь иностранных слов русского языка

ТУБЕРКУЛИН — ТУБЕРКУЛИН, туберкулина, мн. нет, муж. (мед.). Вещество, получаемое из туберкулезных бацилл, используемое при распознавании и лечении туберкулеза. Толковый словарь Ушакова. Д.Н. Ушаков. 1935 1940 … Толковый словарь Ушакова

Туберкулин — см. Манту проба. (Источник: «Словарь терминов микробиологии») … Словарь микробиологии

туберкулин — сущ. кол во синонимов: 2 • препарат (952) • экстракт (27) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

туберкулин — Препарат для постановки аллергических диагностических проб на туберкулез [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN tuberculin … Справочник технического переводчика

туберкулин — общее название препаратов, получаемых из культур микобактерий туберкулеза и предназначенных для постановки аллергических диагностических проб … Большой медицинский словарь

Туберкулин — диагностические препараты, применяемые для выявления аллергической реакции у лиц, инфицированных туберкулёзными бактериями. Впервые получен Р. Кохом. В СССР выпускают: жидкий Т. или альттуберкулин Коха (АТК), получают путём выпаривания… … Большая советская энциклопедия

Туберкулин — или так назыв. лимфа Коха в 1890 г. Robert ом Koch ом был предложен как диагностическое и терапевтическое средство при туберкулезе и встречен с небывалым энтузиазмом не только со стороны публики и ближайших сотрудников Коха, но и с большим… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

Туберкулин — м. Препарат, используемый при диагностике туберкулёза. Толковый словарь Ефремовой. Т. Ф. Ефремова. 2000 … Современный толковый словарь русского языка Ефремовой

туберкулин — туберкулин, туберкулины, туберкулина, туберкулинов, туберкулину, туберкулинам, туберкулин, туберкулины, туберкулином, туберкулинами, туберкулине, туберкулинах (Источник: «Полная акцентуированная парадигма по А. А. Зализняку») … Формы слов

Аллергическая диагностика паратуберкулеза

Для диагностики можно использовать подкожную пробу и внутрикожную двойную пробу. В том и другом случае используется птичий туберкулин.

К аллергической диагностике паратуберкулезного энтерита прибегают только в хозяйствах, в которых точно установлены случаи болезни, при помощи клинико-бактериологической или гистологической диагностики, а также в в соседних фермах, если не исключается возможность соприкосновения здоровых и больных животных.

Клинически больные предварительно удаляются из стада на убой, а затем скот неблагополучного хозяйства исследуется на паратуберкулез. Допускается одновременное исследование на туберкулез и паратуберкулезный энтерит. Если при этом используется внутрикожная проба, то последние производятся по обе стороны шеи.

Внутрикожная проба (двойная) производится на шее. Шерсть предварительно выстригается и кожа очищается и дезинфицируется. Нормальная толщина кожной складки у здоровых коров равна 5—7—9 мм, а у быков 10—15 мм и выше.

Птичий туберкулин вводится в толщу кожи в дозе: телятам до 3 месяцев 0,1 мл, от 6 до 12 месяцев 0,15 мл, от 1 до 2 лет 0,2 мл, от 2 до 3 лет 0,3 мл, и свыше 3 лет 0,4—0,5 мл, в зависимости от состояния животного. Если после введения препарата под пальцем не ощущается образования пузырька величиной с горошину, то это означает, что аллерген введен неправильно. Инъекция в этом случае повторяется.

Через 48 часов после введения аллергена учитываются результаты первой пробы: отмечается характер кожной реакции и измеряется штангенциркулем толщина кожной складки, причем утолщение должно быть на изгибе складки.

Животные, давшие положительную реакцию, дальнейшему испытанию не подвергаются. Всем остальным животным аллерген вводится вторично в то же самое место и в той же дозе. На этот раз реакция учитывается через 24 часа после введения аллергена. Первая инъекция в этом случае является сенсибилизирующей, а вторая—диагностической.

Положительная реакция характеризуется появлением разлитого, болезненного, горячего на ощупь отека и утолщением кожной складки более, чем на 7 мм сверх нормы, установленной до введения препарата. Сомнительная реакция считается при менее выраженных воспалительных явлениях со стороны кожи и увеличения складки по сравнению с нормой на 5—7 мм. Неспецифические отграниченные, безболезненные затвердения, превышающие 5— 7 мм, за типичную аллергическую реакцию не принимаются. Реакции, возникшие раньше 48 часов после введения туберкулина, также не учитываются.

При наличии сомнительных и неопределенных результатов через 5—10 дней производится повторное испытание туберкулиновой пробой на другом участке кожи или на другой стороне шеи. При вторичном неопределенном результате немедленно применяется подкожная проба, по результатам которой делается окончательное заключение о наличии паратуберкулеза у того или иного животного.

Следует иметь в виду, что двойная внутрикожная проба не препятствует применению подкожной пробы до и после нее. Телят можно испытывать внутри-кожной пробой начиная с месячного их возраста.

Подкожная проба. При подкожном применении птичьего туберкулина должны быть созданы условия покоя. Животные привязываются на базах к кормушкам, в жаркие дни под навесом или в хорошо вентилируемых Помещениях. Животные обеспечиваются сочными кормами.

Термометры закрепляются за определенными животными. Устанавливается среднесуточная температура путем троекратного измерения ее в 6,12 и 18 часов, обязательно до водопоя и не ранее чем через 2 часа после водопоя. Животные с нормальной температурой допускаются к подкожной туберкулинизации.

Птичий туберкулин для диагностики паратуберкулезного энтерита применяется в виде 20%-ного раствора его в 0,5%-ной карболовой воде. Приготовленный раствор фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют путем кипячения в течение часа или в автоклаве. Дозы для взрослых животных 10 мл, для молодняка в возрасте до 2 лет 6—8 мл. Туберкулин вводится подкожно на шее.

Непосредственно после туберкулинизации животных необходимо напоить и в дальнейшем, до окончания исследования водопоя не производится во избежание колебаний температуры.

У больных животных подкожное введение птичьего туберкулина вызывает повышение температуры, явления угнетения, потерю аппетита, усталость, дрожание мускулатуры и иногда появление поноса. На месте введения препарата отмечается появление воспалительного отека различной величины.

После введения туберкулина измерение температуры производится через каждые 2 часа на протяжении 12—20 часов, спустя 4 часа после введения препарата.

Положительной реакцией считается температурная с подъемом до 40,0° и выше, но превышающая нормальную температуру не менее, чем на 1°.

Сомнительная реакция характеризуется подъемом температуры от 39,7 до 40,0° и не менее 0,7° выше нормальной. Если температура начинает повышаться спустя 10—12 часов после введения птичьего туберкулина, то такая реакция считается отрицательной и дальнейшее измерение температуры прекращается. Отсутствие температурного подъема и подъем температуры до 0,7° говорит об отрицательной реакции.

Следует учесть, что у большинства животных в предклинической и клинической стадии болезни, а также у тяжело больных термической реакции на введение туберкулина не наблюдается.

Во избежание абортов нельзя производить подкожную туберкулинизацию у коров за 2 месяца до отела вследствие сильной термической реакции и спустя 1/2 месяца после отела, чтобы не сделать ошибочных выводов на основании колебаний температуры по случайным причинам.

Не следует применять подкожную пробу у телят до 6-месячного возраста, учитывая у них значительную лабильность нормальной температуры.

У овец аллергическое исследование на паратуберкулезный энтерит производится неразведенным птичьим туберкулином, который вводится в кожу на внутренней поверхности бедра в дозе 0,3 мл.

Согласно временной инструкции учет реакции производится через 48 часов после введения туберкулина. Появление на месте введения ясно выраженной болезненной отечности и гиперемии с местным повышением температуры рассматривается как положительная реакция. Неясно выраженные признаки расцениваются как сомнительная реакция. При отсутствии местных изменений реакция считается отрицательной.

Животные, давшие сомнительную реакцию, содержатся отдельно от здоровых животных и через месяц исследуются повторно. В неблагополучном хозяйстве повторный сомнительный результат расценивается как положительная реакция. Овцы, давшие отрицательную реакцию, возвращаются в отару здоровых. Клинически больные паратуберкулезом немедленно удаляются без аллергического исследования.

Способ получения туберкулина

Туберкулин предназначен для аллергической диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных. Туберкулин получают выращиванием микробактерий туберкулеза на синтетической питательной среде и отделением культуральной жидкости. Из культуральной жидкости выделяют туберкулин трихлоруксусной кислотой, переосаждают его сульфатом аммония и обессоливают. Обессоленный концентрат фракционируют на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 150 - 1000 кДа. Крупномолекулярную фракцию диафильтруют на тех же мембранах. Далее проводят стерилизующую микрофильтрацию полученных пермеатов. Стерильный раствор белка можно использовать для приготовления ППД-туберкулина сухого или ППД-туберкулина в стандартном растворе. Способ позволяет получать высокоспецифичный, неиммуногенный препарат, более технологичный в изготовлении, а также повысить выход туберкулина. 5 табл.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, в частности к способу получения биологических препаратов, применяемых для аллергической диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на синтетической питательной среде, термоинактивацию туберкулезных культур, освобождение культуральной жидкости от микобактерий путем фильтрации, выделение белков культуральной жидкости последовательным осаждением трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония, стерильную фильтрацию через асбестсодержащие фильтры. (Инструкция по получению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. Утверждена ГУ ветеринарии МСХ СССР в 1985 г.) При этом способе получения туберкулина наиболее уязвимым местом технологии является глубинная стерилизующая фильтрация через асбестовые фильтры. Применение асбестсодержащих глубинных фильтров не позволяет получать гарантированно стерильный препарат. Кроме того, использование большого количества глубинных фильтров приводит к значительным потерям белка, что снижает выход препарата.

Известен способ получения аллергена для диагностики туберкулеза, в котором вместо осаждения белков культуральной жидкостью ее подвергают ультрафильтрации на мембранах с номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 100 кДа и последующему концентрированию на мембранах с НОММ 15 кДа [1].

Однако этот метод не позволяет достаточно полно избавиться от полисахаридов культуральной жидкости, снижающих специфичность препарата. Кроме того, ультрафильтрационное фракционирование и концентрирование больших объемов культуральной жидкости технологически трудно осуществимо из-за длительности процессов и значительных потерь выделяемого белка.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на синтетической питательной среде, отделение культуральной жидкости, выделение из нее туберкулина трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония с последующим обессоливанием раствора туберкулина электродиализом и стерильной фильтрацией [2].

Вышеуказанным способом получается туберкулин, содержащий кроме белковой фракции 8 - 15% полисахаридов, которые, являясь балластными веществами, снижают специфичность туберкулина. Наряду с этим в препарате присутствуют крупномолекулярные белоксодержащие микобактериальные антигены, обладающие высокой иммуногенностью. Целью настоящего изобретения является получение более специфичного диагностического препарата и увеличение выхода туберкулина.

Поставленная цель достигается использованием мембранного фракционирования концентрата белков M.bovis с последующей диафильтрацией и, далее, микрофильтрацией раствора туберкулина.

Предлагаемый способ позволяет получать высокоспецифичный, неиммуногенный препарат, более технологичный в изготовлении, а также повысить выход туберкулина. Это стало возможным благодаря использованию ультрафильтрации и диафильтрации раствора белков, выделенных из культуральной жидкости, на мембранах с НОММ 150 - 1000 кДа и последующей микрофильтрации белкового раствора на мембранах с размером пор 0,2 мкм.

Наиболее важными показателями качества туберкулина являются специфичность, активность, иммуногенность. Поэтому в идеале туберкулин для млекопитающих, изготовленный из фракций M. bovis, не должен вызывать реакций у животных, контактировавших с микобактериями других видов, должен давать четкую реакцию у животных, сенсибилизированных M.bovis, и не должен вызывать при многократных введениях здоровым животным сколько-нибудь выраженных иммунных реакций на антигены препарата.

Антигены разных видов микобактерий близки по составу, что определяет наличие перекрестных реакций у животных, инфицированных различными видами микобактерий.

По мнению авторов, полисахариды микобактерий, а также крупномолекулярные комплексы белков с полисахаридами и липидами опосредуют в значительной степени развитие неспецифических иммунных реакций. Кроме того, крупномолекулярные антигены обладают высокой иммунногенностью. Анализ фракций различных туберкулинов по молекулярной массе методом гель-фильтрации показал наличие крупномолекулярного пика, обогащенного полисахаридами.

Значительное отличие по молекулярной массе крупномолекулярного пика от пиков с меньшей молекулярной массой, содержащих в основном белки туберкулина, позволило разработать метод мембранного фракционирования для отделения иммунногенной и неспецифичной фракции туберкулина.

Авторы предлагают применить процесс ультрафильтрации для отделения из концентрата туберкулина крупномолекулярной фракции, обогащенной полисахаридами. Для этого используют ультрафильтрационные мембраны с НОММ 150 - 1000 кДа. Использование мембран с НОММ меньше 150 кДа снижает скорость процесса ультрафильтрации и при определенных режимах приводит к задержке на мембране специфичных белков препарата, что ведет к возрастанию потерь. Применение мембран с НОММ больше 1000 кДа не позволяет эффективно отделить крупномолекулярную фракцию.

Одно лишь ультрафильтрационное концентрирование не позволяет достаточно полно выделить белки туберкулина с необходимой молекулярной массой, что ведет к снижению эффективности процесса.

Авторы предлагают после ультрафильтрационного концентрирования макромолекул туберкулина подвергнуть полученный концентрат процессу диафильтрации с использованием тех же мембран (НОММ - 150 - 1000 кДА). Оба процесса ультрафильтрационного концентрирования и диафильтрации осуществляются при скорости 30 - 50 - дм 3 /м 2 час и трасмембранном давлении 0,1 - 1,0 бар.

Процессы ультрафильтрационного концентрирования и диафильтрации в тангенциальном потоке позволяют удалить нефильтруемые в обычном режиме микрофильтрации полисахариды и ввести в качестве заключительного этапа технологии стандартную стерильную микрофильтрацию в тупиковом режиме. В существующей технологии конечную фильтрацию препарата проводят на глубинных фильтрах СФ, что ведет к значительным потерям белка.

Таким образом, мембранное фракционирование туберкулина позволило не только исключить неспецифическую и иммунногенную фракцию макромолекул из препарата, но и повысить выход конечного продукта.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Готовят матриксную расплодку M.bovis на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с L-аспарагином). Осуществляют производственный посев и инкубируют культуру в течение 6 - 8 недель при температуре 37 o C, инактивируют посевы в течение 30 мин при температуре 120 o C. Бакмассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием. Из культурального фильтрата высаждают белок 50% раствором трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации 4 - 10%. После центрифугирования осадок растворяют из расчета 1 часть белка и 6 - 10 частей дистиллированной воды, подщелоченной 10%-ным раствором аммиака до pH 7,4 - 7,6. Переосаждают белок равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония при нейтральном значении pH. Белок после центрифугирования растворяют в дистиллированной воде (pH 7,6 - 7,8) в соотношении 1. 5 - 1. 7 и обессоливают. Обессоленный раствор белка подвергают ультрафильтрационному фракционированию на мембранах с НОММ 150 - 1000 кДа с целью отделения крупномолекулярных белков и полисахаридов. Для более полного извлечения активных специфичных белковых аллергенов M. bovis проводят диафильтрацию концентрата на тех же мембранах. Пермеат, полученный при ультрафильтрации и диафильтрации, стерилизуют методом микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,2 мкм.

Стерильный раствор белка используют для приготовления ППД-туберкулина сухого или ППД-туберкулина в стандартном растворе.

Для получения сухого ППД-туберкулина раствор белка фасуют в ампулы или флаконы в зависимости от концентрации и сублимируют.

Для получения ППД-туберкулина в стандартном растворе стерильный раствор белка разбавляют растворителем до необходимой концентрации, нагревают до температуры 90 o C и после охлаждения фасуют.

Предлагаемый способ характеризуется следующим примером.

Пример. Готовили матриксную расплодку на синтетической питательной среде (среда Курской биофабрики с L-аспарагином). Производили посев туберкулезной культуры (M. bovis) на синтетическую питательную среду и инкубировали при температуре 37 o C 8 недель. Инактивировали посевы в течение 30 мин при температуре 120 o C. Бакмассу отделяли от культуральной жидкости фильтрованием. Из культурального фильтрата высаждали белок 50%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации 8%. После центрифугирования осадок растворяли дистиллированной водой, подщелоченной до pH 7,5 из расчета 1 часть белка и 6 частей воды. Переосаждали белок равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония при нейтральном значении pH. После центрифугирования белок растворяли в подщелоченной дистиллированной воде в соотношении 1. 5. Обессоливали раствор белка электродиализом. Обессоленный раствор белка подвергали ультрафильтрационному фракционированию на мембранах с НОММ 300 кДа для отделения крупномолекулярных белков и полисахаридов. Для более полного извлечения активных специфичных белковых аллергенов M.bovis проводили диафильтрацию на тех же мембранах. Пермеат, полученный при фракционировании и диафильтрации, стерилизовали микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2 мкм.

Данные анализов туберкулинов, полученные по предлагаемому способу и по прототипу, приведены в таблицах 1 - 5.

В качестве пояснения к таблицам необходимо отметить следующее.

Как видно из табл. 1, предлагаемый способ позволяет получать туберкулины с более низким содержанием полисахаридов. Так, например, отношение содержания белков к содержанию полисахаридов (К) в опытах составляет в среднем 25,3, тогда как по прототипу эта величина составляет 8,35, т.е. в три раза ниже.

В табл. 2 - 4 приведены результаты сравнения специфичности туберкулинов. Для этого морским свинкам, сенсибилизированным гетерологичными (по отношению к M. bovis) штаммами (M.avium. M. scotochromogenes и M. neochromogenes), вводили равные по содержанию белка или по активности (в системе M. bovis) дозы туберкулинов, полученных по предлагаемому способу и по прототипу.

Средние диаметры ответных реакций на 1000 и 500 ТЕ туберкулина, полученного по предлагаемому способу, меньше средних диаметров ответных реакций таких же доз туберкулина, полученного по прототипу (табл. 2).

При сравнении диаметров ответных реакций равных по белку доз туберкулинов в гетерологичной системе (M. avium) также выявлена достоверно меньшая активность предлагаемого препарата (табл. 3).

Аналогичные данные получены при сравнении туберкулинов по прототипу и по предлагаемому способу на морских свинках, сенсибилизированных атипичными микобактериями (табл. 4).

Таким образом, туберкулин, полученный по предлагаемому способу, проявляет меньшую активность в гетерологичной системе по сравнению с прототипом, т. е. является более специфичным.

При анализе туберкулина, полученного предлагаемым способом в гомологичной системе (на морских свинках, сенсибилизированных M. bovis), установлена его высокая активность (табл. 5).

Несмотря на то что концентрация белков и органических веществ в опытах в два раза ниже, чем по прототипу (0,35 - 0,8 и 0,4 - 1,0 - соответственно), оба препарата показали одинаковую активность. Таким образом, в предлагаемом препарате при активности, соответствующей ГОСТу 16739-88, количество балластных органических веществ снижено более чем в два раза. Этим можно объяснить более высокую специфичность предлагаемого препарата. Относительная активность опытного туберкулина (R) в гомологичной системе равна 0,94, а в гетерологичной 0,23. Т.е. по отношению к прототипу предлагаемый препарат вызывает неспецифические реакции в четыре раза слабее (0,94. 0,23 = 4).

Способ получения туберкулина путем выращивания микобактерий туберкулеза на синтетической питательной среде, отделения культуральной жидкости с последующим выделением из нее туберкулина трихлоруксусной кислотой, переосаждением его сульфатом аммония и обессоливанием раствора туберкулина, отличающийся тем, что после обессоливания концентрат туберкулина фракционируют на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 150 - 1000 кДа, диафильтруют крупномолекулярную фракцию на тех же мембранах и далее проводят стерилизующую микрофильтрацию полученных пермеатов.