Способ сушки биопрепарата в ампулах - патент РФ 2108382 - Кальной С

Способ может быть использован для получения сухих биопрепаратов в ампулах, а также при создании коллекций живых культур микроорганизмов. При сушке биопрепарата в ампулах в процессе сублимации в каждую ампулу подают охлажденный инертный газ при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па. Существенно снижаются энергозатраты и ускоряется процесс сушки.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения сухих биопрепаратов в ампулах, а также при создании коллекций живых культур микроорганизмов.

Заявляемое изобретение направлено на решение задач ускорения процесса лиофильной сушки при сохранении структуры и качества биоматериалов на коллекторной установке типа Долинова.

Известен способ лиофильного высушивания, который включает подготовку, предварительное замораживание материала, сублимацию или переход воды в парообразное состояние непосредственно из твердой фазы (минуя жидкую) в условиях вакуума, удаление испаряемой влаги (Бланков Б.И. Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. -М. Медгиз, 1961, с. 8-9). Удаление паров из препарата осуществляется с помощью охлаждаемых конденсаторов или прокаленного гипса, или адсорбента (например силикагеля). В процессе высушивания из биоматериала удаляется 98/99% свободной и частично связанной воды. При высушивании этим методом физико-химическая структура биоматериала подвергается минимальным изменениям, так как сублимация фиксирует "скелет" биосистемы, чего не наблюдается при сушке биоматериала из жидкого состояния.

Известен способ высушивания частиц растворов при параллельном токе газа и частиц раствора сверху вниз или же во встречных потоках газа и частиц раствора - распылительная сушка (Никитин Е.Е. Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М. Колос, 1971, с. 128-131). Он более производителен. Однако при данном способе высушивание биоматериала производится непосредственно из жидкого состояния минуя стадию сублимации, что ведет к глубоким повреждениям биомолекул. Также отсутствует возможность сушки непосредственно в ампулах или флаконах, возрастает риск контаминации, который при работе с биологическими или фармакологическими объектами должен сводиться к минимуму. Все вышеизложенное существенно ограничивает применение этого метода.

Широко известен также способ высушивания расфасованного биоматериала в камерных вакуумных установках (Никитин Е.Е. Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М. Колос, 1971, с. 113-120). Он включает те же этапы, что и другие способы лиофилизации: расфасовку материала, предварительное замораживание, сублимацию под вакуумом, отвод влаги. В некоторых установках данного типа применяется дополнительный прием, заключающийся в автоматической подаче в камеру газа (азота) или сухого стерильного воздуха. Причем давление газов не должно превышать половины давления пара высушиваемого продукта (там же, с. 76-117). Этот прием за счет понижения вакуума в камере увеличивает теплопроводность, а следовательно, конвенционную подачу тепла к высушиваемому препарату, что ускоряет процесс сублимации.

При всех преимуществах описанного метода - высокая производительность камерных аппаратов, техническое совершенство, низкая остаточная влажность, возможность дозировать препараты, процесс лиофилизации в них занимает продолжительное время - 20-70 ч, что влечет большой расход электроэнергии, высокие трудовые затраты.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ высушивания биопрепаратов на коллекторном аппарате ЦИЭМ Долинова К. Е. (Долинов К. Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. -М. Медицина, 1969, с. 82-84). Этот способ применяется для высушивания дозированных препаратов (живых вакцин, сывороток, микроорганизмов, диагностических препаратов и др.) в небольших объемах (до 2,5 мл в ампуле).

Процесс сушки по этому способу включает: расфасовку биопрепарата по ампулам, предварительное замораживание в охлаждающей жидкости (сухой лед и спирт) при температурах от минус 20 до минус 78 o C, сублимацию под вакуумом при остаточном давлении около 0,9 Па 20-50 ч, удаление влаги.

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: расфасовка биоматериала по ампулам, предварительное замораживание от минус 20 до минус 78 o C, сублимация под вакуумом, удаление влаги.

Недостатком описанного прототипа является длительность лиофилизации (20-50 ч), что влечет большой расход электроэнергии, высокие трудовые затраты. Указанный недостаток обусловлен тем, что в период сублимации идет медленное удаление паров из-за низкой температуры материала, узкого просвета в перешейках ампул, затруднения испарения влаги из глубоких слоев биоматериала (дно и стенки ампул).

Целью предлагаемого изобретения является снижение трудовых энергозатрат в процессе лиофильного высушивания биоматериала на коллекторной установке типа Долинова К.Е. что достигается за счет двукратного ускорения процесса сублимации.

Поставленная цель достигается тем, что биопрепарат расфасовывают, замораживают и сублимируют под вакуумом с подачей в ампулы инертного газа, охлажденного до температуры биопрепарата, при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: продувка биопрепарата в процессе сублимации непосредственно в каждой ампуле сухим, охлажденным до температуры биопрепарата инертным газом (азотом) при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па, что обеспечивает сокращение времени сушки в два раза.

Сублимация превратившейся в лед свободной воды происходит сначала на открытой поверхности, а затем распространяется по поверхностям, граничащим со стенками сосуда и далее по мере удаления льда на все более и более глубокие слои замороженной массы. При этом освобождается сухая пористая масса вещества, состоящая из среды высушивания и биопрепарата и содержащая только связанную воду. Связанная вода в отличие от свободной удаляется только с поверхности всего объема пористой массы, предварительно освободившейся ото льда. Все этапы этого единого процесса высушивания ускоряются в два раза, если дополнительно направить поток инертного, охлажденного до температуры биопрепарата газа, который обладает свойством активно увлекать молекулы водяного пара по направлению к конденсатору влаги, что достигается за счет разницы давлений P = 0,98 - 2,94 Па.

Этот прием помимо двукратного ускорения процесса лиофилизации обеспечивают экономию электроэнергии и снижает трудовые затраты.

Таким образом, между отличительными признаками и целью изобретения существует причинно-следственная связь.

Пример 1. Чистую культуру штамма кишечной палочки, подлежащего лиофильному высушиванию, засевают в 4 пробирки со скошенным агаром, которые инкубируют при 37 o C в течение 18-20 ч. С поверхностей агара всех пробирок делают смыв культуры 2 мл сахарозо-желатиновой среды и в стерильных условиях шприцем с длинной иглой или Пастеровской пипеткой вносят в каждую ампулу по 0,2 мл суспензии клеток, затем ампулы подсоединяют к резиновым цилиндрическим муфтам, закрепленным на коллекторе.

На стеблях ампул имеется сужение, наличие которого в соответствии с эмпирической формулой, характеризующей допустимые оптимальные отношения диаметра прохода и площади испарения где D - диаметр прохода, мм; S_с - площадь испарения, см 2 .

Меньший диаметр является недопустимым для достижения оптимальных условий испарения. В связи в этим в каждую ампулу вводят воздуховодную трубку с диаметром на выходе 0,1-0,3 мм, что позволяет подавать поток газа (азота) перпендикулярно и непосредственно к поверхности высушиваемого материала. Устанавливают расстояние между концами воздуховодных трубок и поверхностью высушиваемой бактериальной массы 2-3 мм. Погружают концы ампул на глубину 25-30 мм в кювету с охлаждающей смесью (сухой лед и спирт), замораживают содержимое ампул в течение 5 мин. Включают вакуумный насос. Проверяют герметичность смонтированной системы по показанию манометрической лампы на шкале вакуумметра. После достижения вакуума до 0,98 Па включают дозатор для подачи через воздуховодные трубки дополнительных потоков азота, который проходит через осушитель, впускной фильтр и охлаждается до температуры суспензии при прохождении его по змеевику по дну кюветы с охлаждающей смесью. Степень открытия дозатора контролируют вакуумметром по снижению вакуума в системе до P = 0,98 Па, что обеспечивает достаточное для активного удаления паров воды из ампул за счет поступления азота через воздуховоды. Через 4 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1 с тем отличием, что разница давлений поступающего и отходящего потоков газа P = 1,96 Па. Через 6 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

Пример 3. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что разница давлений поступающего и отходящего потоков азота P = 2,94 Па. Через 8 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

P ниже 0,98 Па не будет обеспечивать активного удаления паров и сокращения скорости высушивания. Превышение величины P = 2,94 Па приводит к выносу высушиваемого материала за пределы ампулы и рассеиванию его по коллектору.

Скорость лиофильного высушивания препаратов при использовании предлагаемого способа значительно увеличивается и время, затрачиваемое на высушивание бактериальных препаратов, сокращается в два раза при сохранении всех требуемых свойств, предъявляемых к высушиваемым препаратам, в том числе и сохранении высокого уровня жизнеспособности микроорганизмов.

Способ сушки биопрепарата в ампулах, включающий расфасовку биопрепарата, замораживание его, сублимацию под вакуумом, отличающийся тем, что в процессе сублимации в каждую ампулу подают инертный газ, охлажденный до температуры биопрепарата, при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па.

Способ сушки биопрепарата в ампулах

Способ может быть использован для получения сухих биопрепаратов в ампулах, а также при создании коллекций живых культур микроорганизмов. При сушке биопрепарата в ампулах в процессе сублимации в каждую ампулу подают охлажденный инертный газ при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па. Существенно снижаются энергозатраты и ускоряется процесс сушки.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения сухих биопрепаратов в ампулах, а также при создании коллекций живых культур микроорганизмов.

Заявляемое изобретение направлено на решение задач ускорения процесса лиофильной сушки при сохранении структуры и качества биоматериалов на коллекторной установке типа Долинова.

Известен способ лиофильного высушивания, который включает подготовку, предварительное замораживание материала, сублимацию или переход воды в парообразное состояние непосредственно из твердой фазы (минуя жидкую) в условиях вакуума, удаление испаряемой влаги (Бланков Б.И. Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. -М. Медгиз, 1961, с. 8-9). Удаление паров из препарата осуществляется с помощью охлаждаемых конденсаторов или прокаленного гипса, или адсорбента (например силикагеля). В процессе высушивания из биоматериала удаляется 98/99% свободной и частично связанной воды. При высушивании этим методом физико-химическая структура биоматериала подвергается минимальным изменениям, так как сублимация фиксирует "скелет" биосистемы, чего не наблюдается при сушке биоматериала из жидкого состояния.

Известен способ высушивания частиц растворов при параллельном токе газа и частиц раствора сверху вниз или же во встречных потоках газа и частиц раствора - распылительная сушка (Никитин Е.Е. Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М. Колос, 1971, с. 128-131). Он более производителен. Однако при данном способе высушивание биоматериала производится непосредственно из жидкого состояния минуя стадию сублимации, что ведет к глубоким повреждениям биомолекул. Также отсутствует возможность сушки непосредственно в ампулах или флаконах, возрастает риск контаминации, который при работе с биологическими или фармакологическими объектами должен сводиться к минимуму. Все вышеизложенное существенно ограничивает применение этого метода.

Широко известен также способ высушивания расфасованного биоматериала в камерных вакуумных установках (Никитин Е.Е. Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М. Колос, 1971, с. 113-120). Он включает те же этапы, что и другие способы лиофилизации: расфасовку материала, предварительное замораживание, сублимацию под вакуумом, отвод влаги. В некоторых установках данного типа применяется дополнительный прием, заключающийся в автоматической подаче в камеру газа (азота) или сухого стерильного воздуха. Причем давление газов не должно превышать половины давления пара высушиваемого продукта (там же, с. 76-117). Этот прием за счет понижения вакуума в камере увеличивает теплопроводность, а следовательно, конвенционную подачу тепла к высушиваемому препарату, что ускоряет процесс сублимации.

При всех преимуществах описанного метода - высокая производительность камерных аппаратов, техническое совершенство, низкая остаточная влажность, возможность дозировать препараты, процесс лиофилизации в них занимает продолжительное время - 20-70 ч, что влечет большой расход электроэнергии, высокие трудовые затраты.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ высушивания биопрепаратов на коллекторном аппарате ЦИЭМ Долинова К. Е. (Долинов К. Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. -М. Медицина, 1969, с. 82-84). Этот способ применяется для высушивания дозированных препаратов (живых вакцин, сывороток, микроорганизмов, диагностических препаратов и др.) в небольших объемах (до 2,5 мл в ампуле).

Процесс сушки по этому способу включает: расфасовку биопрепарата по ампулам, предварительное замораживание в охлаждающей жидкости (сухой лед и спирт) при температурах от минус 20 до минус 78 o C, сублимацию под вакуумом при остаточном давлении около 0,9 Па 20-50 ч, удаление влаги.

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: расфасовка биоматериала по ампулам, предварительное замораживание от минус 20 до минус 78 o C, сублимация под вакуумом, удаление влаги.

Недостатком описанного прототипа является длительность лиофилизации (20-50 ч), что влечет большой расход электроэнергии, высокие трудовые затраты. Указанный недостаток обусловлен тем, что в период сублимации идет медленное удаление паров из-за низкой температуры материала, узкого просвета в перешейках ампул, затруднения испарения влаги из глубоких слоев биоматериала (дно и стенки ампул).

Целью предлагаемого изобретения является снижение трудовых энергозатрат в процессе лиофильного высушивания биоматериала на коллекторной установке типа Долинова К.Е. что достигается за счет двукратного ускорения процесса сублимации.

Поставленная цель достигается тем, что биопрепарат расфасовывают, замораживают и сублимируют под вакуумом с подачей в ампулы инертного газа, охлажденного до температуры биопрепарата, при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: продувка биопрепарата в процессе сублимации непосредственно в каждой ампуле сухим, охлажденным до температуры биопрепарата инертным газом (азотом) при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па, что обеспечивает сокращение времени сушки в два раза.

Сублимация превратившейся в лед свободной воды происходит сначала на открытой поверхности, а затем распространяется по поверхностям, граничащим со стенками сосуда и далее по мере удаления льда на все более и более глубокие слои замороженной массы. При этом освобождается сухая пористая масса вещества, состоящая из среды высушивания и биопрепарата и содержащая только связанную воду. Связанная вода в отличие от свободной удаляется только с поверхности всего объема пористой массы, предварительно освободившейся ото льда. Все этапы этого единого процесса высушивания ускоряются в два раза, если дополнительно направить поток инертного, охлажденного до температуры биопрепарата газа, который обладает свойством активно увлекать молекулы водяного пара по направлению к конденсатору влаги, что достигается за счет разницы давлений P = 0,98 - 2,94 Па.

Этот прием помимо двукратного ускорения процесса лиофилизации обеспечивают экономию электроэнергии и снижает трудовые затраты.

Таким образом, между отличительными признаками и целью изобретения существует причинно-следственная связь.

Пример 1. Чистую культуру штамма кишечной палочки, подлежащего лиофильному высушиванию, засевают в 4 пробирки со скошенным агаром, которые инкубируют при 37 o C в течение 18-20 ч. С поверхностей агара всех пробирок делают смыв культуры 2 мл сахарозо-желатиновой среды и в стерильных условиях шприцем с длинной иглой или Пастеровской пипеткой вносят в каждую ампулу по 0,2 мл суспензии клеток, затем ампулы подсоединяют к резиновым цилиндрическим муфтам, закрепленным на коллекторе.

На стеблях ампул имеется сужение, наличие которого в соответствии с эмпирической формулой, характеризующей допустимые оптимальные отношения диаметра прохода и площади испарения где D - диаметр прохода, мм; S_с - площадь испарения, см 2 .

Меньший диаметр является недопустимым для достижения оптимальных условий испарения. В связи в этим в каждую ампулу вводят воздуховодную трубку с диаметром на выходе 0,1-0,3 мм, что позволяет подавать поток газа (азота) перпендикулярно и непосредственно к поверхности высушиваемого материала. Устанавливают расстояние между концами воздуховодных трубок и поверхностью высушиваемой бактериальной массы 2-3 мм. Погружают концы ампул на глубину 25-30 мм в кювету с охлаждающей смесью (сухой лед и спирт), замораживают содержимое ампул в течение 5 мин. Включают вакуумный насос. Проверяют герметичность смонтированной системы по показанию манометрической лампы на шкале вакуумметра. После достижения вакуума до 0,98 Па включают дозатор для подачи через воздуховодные трубки дополнительных потоков азота, который проходит через осушитель, впускной фильтр и охлаждается до температуры суспензии при прохождении его по змеевику по дну кюветы с охлаждающей смесью. Степень открытия дозатора контролируют вакуумметром по снижению вакуума в системе до P = 0,98 Па, что обеспечивает достаточное для активного удаления паров воды из ампул за счет поступления азота через воздуховоды. Через 4 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1 с тем отличием, что разница давлений поступающего и отходящего потоков газа P = 1,96 Па. Через 6 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

Пример 3. Выполняется аналогично примеру 1, за исключением того, что разница давлений поступающего и отходящего потоков азота P = 2,94 Па. Через 8 ч культура имеет вид сухой пористой массы, сформированной в виде таблетки.

P ниже 0,98 Па не будет обеспечивать активного удаления паров и сокращения скорости высушивания. Превышение величины P = 2,94 Па приводит к выносу высушиваемого материала за пределы ампулы и рассеиванию его по коллектору.

Скорость лиофильного высушивания препаратов при использовании предлагаемого способа значительно увеличивается и время, затрачиваемое на высушивание бактериальных препаратов, сокращается в два раза при сохранении всех требуемых свойств, предъявляемых к высушиваемым препаратам, в том числе и сохранении высокого уровня жизнеспособности микроорганизмов.

Способ сушки биопрепарата в ампулах, включающий расфасовку биопрепарата, замораживание его, сублимацию под вакуумом, отличающийся тем, что в процессе сублимации в каждую ампулу подают инертный газ, охлажденный до температуры биопрепарата, при разнице давлений поступающего и отходящего потоков P = 0,98 - 2,94 Па.

Диссертация на тему «Разработка биолюминесцентного метода определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах» автореферат по специальн

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Специфическая профилактика сальмонеллезов сельскохозяйственных животных

1.2. Производство лиофилизированных бактериальных вакцин 15 1.2. 1. Факторы, влияющие на выживаемость бактерий при изготовлении лиофилизированных вакцин

1. 2. 1. 1. Условия культивирования микроорганизмов. 17 1.2. 1.2. Концентрация бактерии в суспензии 20 1.2. 1.3. Устойчивость разных видов микроорганизмов к замораживанию-высушиванию 23 1.2. 1.4. Защитные среды и криопротекторы 23 1.2. 1.5. Сублимационное высушивание биопрепаратов

2. 1.6. Остаточная влажность препарата 27 1.2. 1.7. Газовая фаза гфи хранении сухих биопрепаратов и повреждающее действие кислорода

1.2. 1.8. Условия хранения высушенных вакцин

1. 2. 2. Контроль лиофилизированных вакцин

1.3. Косвенные методы определение количества жизнеспособных микробных клеток

1. 4. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люциферинлюциферазной системы светляков 35 1.4. 1. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач 36 1. 4. 2. Методология биолюминесцентного определения количества микробной биомассы

1. 4. 2. 1. Подготовка образцов для определения АТФ

1. 4. 2. 2: Методы экстракции внутриклеточного АТФ

1. 4. 2. 3. Применение АТФ-метрии для контроля качества защитных сред при изготовлении лиофилизированных вакцин

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. 1. Вещества, реагенты и материалы 45 2. 2. Объекты исследования 45 2. 3. Использованная аппаратура 46 2. 4. Методики проведения экспериментов 46 2. 4. 1 Получение лиофилизированной вакцины S. typhimurium 46 2. 4. 1. 1. Приготовление культуры S. typhimurium 46 2. 4. 1. 2. Приготовление защитной среды

2. 4. 1.3. Приготовление суспензии бактерий с определенной концентрацией

2. 4. 1. 5. Контроль остаточной влажности 48 2. 4. 2. Определение количества живых бактерий методом посева предельных разведений 48 2. 4. 3. Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом

2. 4. 3. 1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ

2. 4. 3. 2. Измерение биолюминесцентного сигнала •

2. 4. 3. 3. Расчет концентрации АТФ 50 2. 4. 4. Расчет титра клеток по результатам биолюминесцентных измерений

2. 5. Статистическая обработка результатов

2. 6. Результаты и обсуждения

2. 6. 1. Изготовление опытных серий живой вакцины на основе производственного штамма S. typhimurium N3 и изучение влияния рН защитной среды и разных режимов лиофилизации на выживаемость бактерий стр

2. 6. 1. 1. Изучение влияния рН защитной среды на выживаемость бактерий S.typhimurium

2. 6. 1. 2. Разработка оптимального режима сублимационной сушки S. typhimurium

2. 6. 2. Биолюминесцентное определение количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах S.typhimurium

2. 6. 2. 1. Оптимизация измерения концентрации внутриклеточного АТФ в бактериальных суспензиях

2. 6. 2. 2. Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах S.typhimurium с использованием стандартных АТФрастворов (первый способ)

2. 6. 2. 3. Определение титра клеток в лиофилизированных вакцинах S.typhimurium с использованием стандартных АТФэкстрактов (второй способ)

2. 6. 3. Определение титра клеток в лиофилизированных бактериях Е. coli штамм 115 ив промышленных образцах вакцин биолюминесцентным методом

Производство ветеринарных бактериальных вакцин основано на использовании культур микроорганизмов. Длительное сохранение жизнеспособности вакцинного штамма требует определенных условий и достигается в настоящее время несколькими способами: периодическим рекультивированием в случае стабильных штаммов, хранением в глубоко замороженном или в лиофилизированном состоянии. Последний метод позволяет продолжительное время сохранять почти без изменений все свойства биопрепарата или продуцента, не требует больших экономических затрат при изготовлении и хранении [47].

Однако лиофилизация бактериальных культур - сложный технологический процесс, в результате которого некоторая часть микроорганизмов отмирает [56]. Поэтому необходимо разработать такие условия лиофилизации, которые позволяют сохранять наибольший процент жизнеспособных клеток после высушивания.

Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что большинство физических, химических и биологических процессов при производстве сухих биопрепаратов влияют на количество живых микробных клеток в конечном продукте [1, 33, 38, 66, 72].

Для производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза водоплавающих птиц в лабораторных условиях был определен оптимальный состав защитной среды и концентрация микробных клеток в 1 мл исходной суспензии, что позволило получить 60-70 % жизнеспособных клеток после лиофилизации [33]. Однако остается значительное количество малоизученных факторов, влияющих на выживаемость бактерий в процессе лиофилизации.

До сих пор условия лиофилизации бактерий подбираются эмпирическим путем: изменяют какой-либо технологический параметр и определяют выживаемость бактерий. Для этого используют метод посева на питательную среду предельных разведений препарата, после чего подсчитывают количество колониеобразующих единиц ( КОЕ ) до лиофилизации и после.

Метод определения КОЕ является трудоемким, субъективным и требует много времени на выращивание и подсчет колоний. Поэтому при разработке оптимальных условий лиофилизации исследователи, изменяя какой-либо параметр сублимационного высушивания, редко определяют непосредственно выживаемость микроорганизмов после лиофилизации, а чаще измеряют остаточную влажность препарата, которая, как показывают литературные данные, влияет на сохранность живых бактерий в ходе длительного хранения [1, 15, 18, 24, 27].

В настоящее время в биотехнологических производствах все шире используют ускоренные (косвенные) методы определения титра клеток. Эти методы основаны на измерении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди большого разнообразия методов, используемых для этих целей, высокой точностью, воспроизводимостью и экономичностью отличаются методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозинтрифосфата ( АТФ ).

АТФ - универсальный внутриклеточный метаболит, который содержится в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро

- и макроорганизмов. Его количество с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультра малом содержании в образце - до 10"14-г10"15 моль/юовета люминометра [16].

После гибели клетки содержание АТФ, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд [75]. Поэтому по содержанию внутриклеточного АТФ в анализируемом образце можно определять только жизнеспособные клетки. Это представляет практический интерес для подсчета количества живых микроорганизмов в препарате, подвергнутых значительным стрессовым воздействиям (замораживание-оттаивание, лиофилизация и др.).

В настоящее время процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в разных областях биометрии. Многие фирмы производят коммерчески доступные АТФ-реагенты и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика. Все это обусловливает возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах. Следует отметить, что биологические образцы, как правило, помимо микробного (целевого) АТФ содержат соматический и/или внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию целевого на несколько порядков [57, 92]. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток и/или удаление из образца нецелевого АТФ. Методика пробоподготовки образца зависит от его состава, поэтому для конкретного образца очень важно подобрать и оптимизировать условия её проведения.

Цель наших исследований состояла в изыскании оптимальных параметров лиофилизации S. typhimurium N3 и разработке методики биолюминесцентного определения- титра живых бактерий в готовых вакцинах.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) Изготовить опытные микросерии живой вакцины на основе производственного штамма S. typhimurium N3 и использовать их в качестве основной модели для биолюминесцентных исследований и изучить при этом влияния рН защитной среды и режимов лиофилизации на выживаемость бактерий.

2) Оптимизировать условия подготовки образцов для измерения концентрации внутриклеточного АТФ в бактериальных суспензиях, полученных из лиофилизированных вакцин.

3) Разработать методику биолюминесцентного определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах.

4) Испытать предлагаемую методику на лиофилизированных препаратах бактерий Escherichia coli N115 и на промышленных образцах вакцин: "Бивалентной вакцине против сальмонеллеза свиней из аттенуированных штаммов сальмонелла тифимуриум N3 и сальмонелла холераесуис N9" (изготовлена ФГУП Армавирская биофабрика в сентябре-мес. 2001 г.) и "Вакцине против. сальмонеллеза овец" (изготовлена ФГУП Ставропольская биофабрика в июне-мес. 2001 г.). v

Впервые для биолюминесцентного определения количества живых бактериальных клеток в лиофилизированных вакцинах предложено использовать стандартные АТФ-экстракты (растворы АТФ, которые получены из бактериальных суспензий с известным титром). Показано, что использование стандартных АТФ-экстрактов повышает точность биолюминесцентного анализа и упрощает процедуру расчета.

Установлено, что для лиофилизации штамма S.typhimurium N3 оптимальной является защитная среда со значениями рН от 8,0 до 9,0.

Показано, что существенное влияние на выживаемость бактерий после лиофилизации оказывает режим сублимационного высушивания.

Разработана методика биолюминесцентного экспресс-определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах.

- Утверждены и рекомендованы к использованию в научных лабораториях методические рекомендации по биолюминесцентному определению количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах.

- Для технологии производства бактериальной вакцины против сальмонеллеза водоплавающих птиц разработан оптимальный режим сублимации.

Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции "Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов" (14-15 февраля 2001 г.) и на Московском Международном ветеринарном конгрессе (12-15 мая 2002 г.).

Проведены комиссионные испытания биолюминесцентного метода определения количества жизнеспособных клеток в лиофилизированных вакцинах и подготовлены "Методические рекомендации по биолюминесцентному определению жизнеспособных бактерий в лиофилизированных вакцинах", которые доложены научно-проблемной методической комиссии ФГУ ВГНКИ 23 мая 2002 г. и утверждены директором института.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработка оптимальных параметров технологии сублимационного высушивания S. typhimurium N3.

- Разработка методики биолюминесцентного определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах.

1. Разработан новый высокоэффективный экспресс-метод биолюминесцентного определения жизнеспособных клеток в лиофилизированных бактериальных вакцинах.

2. Установлено, что для определения титра живых бактерий биолюминесцентным методом использование стандартных АТФ-растворов нецелесообразно (Rs=0,57).

3. Использование стандартных АТФ-экстрактов при определении живых бактерий в лиофилизированных вакцинах биолюминесцентным методом позволяет получать результаты, которые хорошо совпадают с результатами, полученными стандартным методом посева серийных разведений (Rs=0,95).

4. На выживаемость бактерий после лиофилизации влияет рН защитной среды. Для штамма S.typhimurium N3 оптимальной является защитная среда со значениями рН от 8,0 до 9,0.

5. Предложенный режим технологии лиофилизации продолжительностью до 26 часов позволяет получать вакцины с высоким содержанием живых бактерий S.typhimurium в процессе высушивания (80,0 - 95,0%).

Предложена методика биолюминесцентного экспресс-определения титра живых бактерий в лиофилизированных вакцинах. Метод может быть рекомендован для использования в лабораторных исследованиях при определении титра живых бактерий (неспоровые формы) в бактериальных суспензиях с минимальнои концентрацией 5x106 КОЕ/мл.

Для технологии производства бактериальной вакцины против сальмонеллеза водоплавающих птиц разработан оптимальный режим сублимации, позволяющий получать вакцину с высоким содержанием живых микробных клеток.

1. Апсите А. Ф. Влияние степени обезвоживания на жизнеспособность клубеньковых бактерий люцерны. // Микробный синтез биологически важных веществ. Рига. Зинатне, 1968, С. 99-104.

2. Аркадьева 3. А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения. // Биологические науки, N 4, 1983, С. 93-105

3. Бекер М. Е. Торможение жизнедеятельности микроорганизмов обезвоживанием. // Успехи микробиологии, 1972, Т. N 8, С. 224.

4. Бекер М. Е. Дамберг Б. Э. Рапопорт А. И. Анабиоз микроорганизмов. //Рига. Зинатне, 1981.

5. Белоус А. М. Цветков У. Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. Киев: Наукова думка, 1985, 113с.

6. Белоус А. М. Бондаренко В. А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. // Наукова думка. Киев, 1982, 400 с.

7. Бирюков В.В. Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М. Наука, 1985 г. 289 с.

8. Бровко Л. Ю. Трдатян И. А. Угарова Н. Н. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы. // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. N. 1. С. 134-140.

9. Беккер Г. Бергер В. Домшке Г. и др. Органикум. Практикум по органической химии. М. Мир, 1979. Т. 2. 360 с.

10. Бланков Б. И. Клебанов Д. А. Применение лиофилизации в микробиологии. // Медгиз. М. 1961, С. 209-211.

11. Вопросы криоконсервирования биологических объектов. // Под ред. Н. С. Пушкаря. Киев: Наукова думка, 1978, 132 с.

12. Вакцина против сальмонеллеза свиней из супрессорного ревертанта Сальмонелла холерасуис N 9. // Технические условия 10. 07. 21591.

13. Герна Р. Хранение микроорганизмов. // В кн. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхарда. М. Мир, т. 1, 1983, С. 512-536

14. Деменьтьева Е.И. Лундовских И.А. Кутузова Т.Д. Угарова Н.Н. Патент на изобретение N 2164241. 1999. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата.

15. Данилова М.В. Надирова И.М. и др. Жизнеспособность лиофилизированных бактерий в зависимости от температуры охлаждения. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1981, № 2, с. 307-309.

16. Данилова М. В. Надирова И. М. Емцева Г. В. Зависимость жизнеспособности бактерий после лиофилизации и при длительном хранении от величины остаточной влажности. // Известия АН СССР, Серия биологическая. 1980. - N 3. - С. 449-451.

17. Дамберг Б. Э. Графф Л. Влияние обезвоживания на митохондрии и газообмен дрожжей. // Биотехнология и биоинженерия. Продукты и среды микробного синтеза, 1978, Выпуск 2, С. 60-61.

18. Заерко В. И. Производство живых вакцин против сальмонеллеза животных на питательных средах из непищевого сырья. 7/ Авторефератдиссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. М, 1996. 18 с.

19. Звягин И. В. Хорьков И. А. Токарик Э. Ф. Нежута А. А. и др. // Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов. М. 1981, 34 с.

20. Иосипенко А.Д. Щеголев С.Ю. Шендеров Б.А. и др. Спектротурбидиметрический метод быстрой оценки чувствительности микроорганизмов к действию антибиотиков. // Антибиотики. 1985. Т.ЗО. N. 3. с.208-212.

21. Иванова JI.B. Бровко Л.Ю. Шеховцова Т.Н. и др. Ц Журн. вналит. химии. 1986.Т. 41. Вып. 4. с. 743—749.

22. Иванов М. М. Малахова Т. И. Складчиков Р. В. Климанов А. И. Значение остаточной влажности для сохранения иммуногенных свойств бруцеллезной вакцины. // Труды ГНКИ ветпрепаратов. 1974. - Т. 20. С. 156-161.

23. Калакутский Л. В. Сидякина Т. М. Сохранение жизнеспособности микроорганизмов в природе и основные подходы к консервации лабораторных культур. // Торможение жизнедеятельности клетки. Рига, 1987, С. 19-31.

24. Кадникова Н. Г. Колониеобразующая способность криоконсервированных бифидобактерий в зависимости от концентрации бактерий в суспензии. // Сборник научных трудов: Влияние охлаждения на биологические объекты. Харьков, 1990, С. 68-71.

25. Кветков В. П. Методические рекомендации по определению остаточной влажности в лиофилизированных препаратах. // Омск, 1972.

26. Кравченко А. Т. Фихман Б. А. Калина А. П. Закономерности проявления анабиоза и рациональные методы его практического применения. // Материалы ежегодной научн. конф. посвященной памяти Л. А. Тарасевича. М. 1964, С. 223-225.

27. Ленев С. В. Малахов Ю. А. Шорохов В. В. Профилактика и диагностика сальмонеллезов сельскохозяйственных животных. // Сборник научных трудов ВГНКИ. Т. 62, М. 2001. С. 52-57.

28. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. // Под ред. Н.А.Красильникова, М. Наука, 1967.

29. Никитин Е. В. Звягин И. В. Замораживание и высушивание биологических препаратов.//М. Колос, 1971.

30. Опарин Ю.Г. Богаутдинов 3. Ф. Яблочник Б. М. и др. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов, 1991, Т. 54, С. 15-17.

31. Опарин Ю.Г. Богаутдинов 3. Ф. Пивоварова И. К. и др. Совершенствование технологии лиофильного высушивания производственного штамма Salmonella typhimurium. // Биотехнология, 1996, N9, с 29-31.

32. Опарин Ю. Г. Сродство к электрону некоторых стабилизаторов биоматериалов. // Биотехнология, 1997, N 2, С. 44-48.

33. Опарин Ю. Г. Подходы к определению оптимального режима лиофилизации биопрепаратов. // Биотехнология. 1997. - N 7-8. С. 69-74.

34. Опарин Ю. Г; Определение температурной зоны сублимации льда в биопрепаратах с помощью прибора ПИТП-1. // Биотехнология. 1997. - N 7-8. С. 75-78.

35. Осин И. С. Гаврилова И. А. Петухов В. Г. Востановление дыхания и потребления глюкозы бактериями после лиофилизации. // Микробиология, 1980, 49, N2, С. 253-257.

36. Пучков Е. О. Говорунов И. Г. Общая характеристика методов хранения бактериальных культур. // Проблемы криоконсервации бактериальных культур. Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1983,23 с.

37. Прилуцкая Е. И. Подготовка колибактерина к лиофилизации. // Киев: Наукова думка, 1978, С. 45-48.

38. Пархоменко И.М. Перишвили Г.В. Туровецкий В.Б. Кудряшов Ю.Б. Рубин А.Г. Бровко Л.Ю. Эффект малых доз. // Радиобиология. 1993. Т.ЗЗ. N.1. с.104-109.

39. Писаренко Н.Н. Усовершенствование методов контроля и вопросы стандартизации вакцины БЦЖ. // Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. М. 1970, 24 с.

40. Пушкарь Н. С. Белоус А. М. Введение в криобиологию. // Киев. Наукова думка, 1975, С. 115-122.

41. Печникова И. В. Влияние состава среды высушивания, на термоустойчивость чумной живой сухой вакцины ЕВ в процессе длительного хранения. // Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Саратов, 1967, 19 с.

42. Романова Н. А. Бровко Л. Ю. Сепульведа-Бессера М. Угарова Н. Н. Изменение пула адениновых нуклеотидов в клетках бактерий E.colil257 при воздействии низкоинтенсивного Не-№-лазера. // Биохимия. 1993. Т.58.1. Вып.З. с.376-384.1

43. Ре Л. Консервация жизни холодом. М. Медгиз, 1962.

44. Сидякина Т. М. Консервация микроорганизмов. // Сер. Консервация генетических ресурсов. Пущино: Изд. ОНТВ НЦ БИ АН СССР, 1985, 63 с.

45. Тинкер А. И. Влияние сублимационного (лиофильного) высушивания на штамм ЕВ чумного микроба. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М, 1971. 49 с.

46. Угарова Н.Н. Бровко Л.Ю. и др. Способ иммобилизации люциферазы светляков. Авторское Свидетельство N 660378 от 08.01.1987.

47. Угарова Н. Н. Бровко Л. Ю. Лебедева О. В. Березин И. В. Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики. // Вестник Академии Медицинских Наук СССР. 1985. N 7, с. 88-94.

48. Угарова Н.Н. Биоаналитические применения люциферазы светляков. // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т.29. N.2. с. 180191.

49. Угарова Н.Н. Бровко Л.Ю. Лебедева О.В. Иммобилизованные биолюминесцентные системы. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. Т.6. М. ВИНИТИ. 1986. С.88-163.

50. Угарова Н.Н. Бровко Л.Ю. Трдатян И.А. Райнина Е.И. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии. // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. Т23. N.1. С. 14-24.

51. Фатеева М.В. Казаков Р.А. и др. Об "эвтектической" температуре дрожжевых суспензий при замораживании, оттаивании и лиофилизации. // Микробиология, 1970, Т. 39, № 6, С. 958-964.

52. Фатеева М. В. Никитина Т. Н. и др. Изучение условий лиофилизации дрожжей с применением методов планирования эксперимента. // Микробиология, 1976, Т. 45, N 5, С. 905-909.

53. Фрунджян В. Г. Бабунова В. С. Бровко Л. Ю. Карташова В. М. Угарова Н. Н. Биолюминесцентное определение общей бактериальной обсемененности сырого молока. // Молочная Промышленность. 1998. N6. С.38-39.

54. Фрунджян В.Г. Бровко Л.Ю. Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувствительности септической крови. // Прикладная биохимия микробиология. 1997. Т.ЗЗ. N.4. С.455-460.

55. Цуцаева А. А. Сафонова Т.С. и др. Влияние физиологического состояния клеток E.coli на чувствительность к действию низких температур. //'Микробиология, 1980, Т. № 49, С. 179-182.

56. Цуцаева А. А. Микулинский Ю. Е. Высеканцев И. П. и др. Холодовой стресс и биологические системы. // Киев, Наукова думка, 1991, 176 с.

57. Цуцаева А. А. Сафонова Т. С. и др. Влияние низких температур (-196°С) и криопротекторов на некоторые виды бактерий.//Микробиология, 1978, Т. 47, № 3, С. 446-450.

58. Шустер Б. Ю. Малахов Ю. А. Кириллова В. В. Вакцина против сальмонеллеза водоплавующих птиц. // Новое в борьбе с болезнями птиц. Л. 1984, с. 24-26.

59. Ashwood-Smith M.J. Preservation of microorganisms by freezing, freeze-drying and dessiccation. // In: Low temperature, preservation in medicine and biology. Ed. by M. J. Ashwood-Smith and J. Parrant, Pitman Press, London, 1980, p. 219-252.

60. Antheunisse J. et al. Viability of microorganisms after drying and storage. // Antonie van Leeuwenhoek, 1981, v. 47, N 6, p. 539-545.

61. Antheunisse J. Arkesteyn-Dijksman L. Rate of drying and the survival of microorganisms. // Antonie van Leeuwenhoek, 1979, v. 45, № 1, p. 177-184.

62. Ashwood-Smith M.J. Grant E. Mutations in duction in bacteria by freeze—drying. // Cryobiology, 1976, v. 13, № 2, p. 206-213.

63. Bishop J.R. White C.H. Assessment of dairy product quality and potential shelf-life. A review. // J. Food Protection. 1986. V.49. N.9. P.739-753.

64. Bautista D.A. Mclntyre L. Laleye L. Griffiths M.W. The application of ATP bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene. // J. Rapid Methods and Automation in Microbiology. 1992. V.l. P. 179-193.

65. Botha W.C. Luck J. Jooste P.J. The application of adenosine triphosphate method as a rapid bacteriological platform test. // South African J. Dairy Technology. 1985. V.17. P.59-64.

66. Bousfield I. J. Mackenzie A.R. Inactivation of bacteria by freeze-drying. // In: Inhibition and inactivation of vegetative microbes. Ed. by F. A. Skinner and W. B. Hugo. Acad. Press, N. Y. 1976, p. 329-344.

67. Gibson D.M. Some modification of the media for rapid automated detection of salmonellas by conductance measurement. // J. Applied Bacteriology. 1987. V.63. P.299-304.

68. Calcott P.H. Transient loss of pi as midmedia ted mercuric resistance effect after stress in Pseudomonas aeroginosa. // Appl, Environ, Microbiology, 1981, v. 41, T.N 6, p. 1348-1354.

69. Lee S. K. Calcott P. H. Macleod R. A. Relationship between of cytochrom content and sensitivity of bakteria to NaCI on freezing and thawing. // Can. J. Microbiology, 1977, v. 5, N 4, p. 413-419.

70. Ogden I.D. Cann D.C. A modified conductance -method for the detection of Salmonella spp. // J. Applied Bacteriology. 1987. V.63. P.459-464.

71. О'Tool D.K. A review. Methods for the direct and indirect assessment of the bacterial count of milk. // J. Applied Bacteriology. 1983. V.55. N.2. P.187-201.

72. Purnendu C.V. Rapid methods and automation in dairy microbiology. J. Dairy Science. 1993. V.76. P.3101-3113.

73. Rowlands A. Barlcworth H. Hoslcing Z. Kemphorne O. Dye tests as measures of the keeping quality of milk. // J. Dairy Research. 1950. V. 17. P. 161191.

74. Sala-Newby G.B. Goodfield C. Johnson I.R. et al. Ultra-sensitive detection of microbes by ATP analysis. In: ATP Luminescence: Society for the Applied Bacteriology. 1989. P.261-269.

75. Noviclc O. Isnaeli E. Kohn A. Nucleic acid and protein synthesis in reconstituted lyophilized Escherichia coli exposed to air. // J. Appl. Bacteriology, 1972, v. 35, N2, p. 185-191.

76. Calcott P. H. Lee S. K. Mac Leod R.A. The effect of coolingand wanning rates on the survival of a variety of bacteria. // Canad. J. Microbiology, 1976, v. 22, № 1, p. 106-109.

77. Nei Т. Araki Т. Matasusaka T. Freezen injury to aerated and nonaerated cultures of Escherichia coli. // In: Freezing and drying of microorganisms. Ed. By T. Ney. University of Tokyo Press, Tokyo, 1969, p. 3-15.

78. Gast R.K. Paratyphoid infections. // Diseases of poultry. —10 th ed. -1997.

79. Salmonella // 7 Misset World Poultry.- 1996.- Vol. 12,- Supp.l.

80. Milcula I. Pilipmec E, Topical trends of applicatoins of salmonella vaccines in animals // Proceedings. -2a.- 1987.

81. Heclcly R. J. Preservation of microorganisms. // Adv. Appl. Microbiology, Acad. Press, N.Y. 1978, v. 24, p. 1-53.

82. Kennedy J.E. and J.R. Oblinger J.I. Application of bioluminesence to rapid determination of microbial levels in ground beef. // J. Food Protection. 1985. V.48. N.4. P.334-340.

83. Lundin A. Analytical application of bioluminescence: the firefly system. / Clinical and Biochemical Luminescence. Eds. Kricka L.J. & Carter T.J.N. N.Y. Marcel Dekker Inc. 1982. P.43-74.

84. Cousins C.M. Rodrigues U.M. Fulpord R.J. The pyruvate test for monitoring the bacteriological quality of raw silo milk. // J. Dairy Research. 1981. V.48. P.45-50.

85. Sala-Newby G.B. Goodfield С. Johnson I.R. et al. Ultrasensitive detection of microbes by ATP analysis. In: ATP Luminescence: Society for the Applied Bacteriology. 1989. P.261-269.

86. Gibson D.M. Some modification of the media for rapid automated detection of salmonellas by conductance measurement. // J. Applied Bacteriology. 1987. V.63. P.299-304.

87. Mackenzie A. P. Collapse during freeze drying qualitative and quantitative aspects. // Freeze drying and Advanced Food Technology - 1975.-P. 277-307.

88. Dukhovich A. F. Philippova K.Y. Ugarova N.H. // Bioluminescence and Chemiluminescence, Current Status / Eds Stanley Ph. E. Kricka L.J. Chichester: Yohn Wiley, 1991. P. 507—510.

89. Ugarova К. H. Vozny Y. V. Kutuzova G.D. Dementieva E.I. // Biolumineicence and Chemiluminescence. Current Status / Eds Stanley Ph. E. Kricka L.J. Chichester: Yohn Wiley 1991. P. 511—514.

90. Subramani S. De Luce M. // OCT. engeoeer. 1988. V. 10. P. 75—89.

91. Cutter C.N. Dorsa W.J. Siragusa G.R. A rapid microbial ATP bioluminescence assay for meat carcasses. // Dairy, Food and Environmental Sanitation. 1996. V. 16. N. 11. P.726-736.

92. Selan L. Berlutti F. Passariello C. Thaller MC. Renzini G. Reliability bioluminescence ATP test for detection of bacteria. // J Clin Microbiol. 1992; V. 30. N7. P. 1739-1742.

93. Yamazaki Т. Sato N. Yamashita K. Okazawa Y. Tanno K. Antimicrobial test of a susceptibility for Mycobacterium tuberculosis bioluminescence by test mycobacterial ATP use filamentous processing cell. // J Environ Health. 2001. August; P. 9-14.

94. Champiat D, Matas N, Monfort B, Fraass H. The applications biochemiluminescence to HACCP. // Anal. Biochem. 2000. Sep 10. P. 394-400.

95. Graumlich T.R. Estimation of microbial population in orange juice by bioluminescence.//J. Food Science. 1985. V.50. P.116-117.

96. Levin G.V. Schort J.R. Hess W.C. Methodology for application of adenosine triphosphate determination in waste water treatment. // Environmental Science Technology. 1975. V.10. P.951-965.

97. Kahru A. Vilu R. Use of luciferin-luciferase assay of ATP for measuring the bacterial growth: Application to Escherichia coli. II Acta Biotechnology. 1988. V.8. N.l. P.93-98.

98. Stanley P. Introduction to ATP rapid microbiology. // Bioluminescence and Chemiluminescence, 1992, Vol. 7, P. 255.

99. Webster J.A.J. Hampton G.J. Leach F.R. ATP in soil: a new extractant and extraction procedure. // Soil Biology and Biochemistry. 1984. V.16. N. 4. P.335-342.

100. Jenkinson D.C. Oades J.M. A method for measuring of adenosin triphosphate in soil. // Soil Biology and Biochemistry. 1979. V.l 1. P.193-199.

101. Lundin A. Thore A. Comparison of methods for extraction of bacterial adenine nucleotides determined by firefly assay. // Applied Microbiology. 1975. V.30. N.5. P.713-721.

102. Sheppard E.P. Gow J.A. Georghiou P.E. Luciferin-luciferase assay of ATP from bacteria. A comparison of DMSO and acetone with other solvents. // Microbios. 1987. V.52. N.210. P.39-50.

103. Webster, Hall M.S. Rich C.N. Gilliland S.E. Ford S.R. Leach F.R. Improved sensitivity of the bioluminescent determination of numbers of bacteria in milk samples. // J. Food Protection. 1988. V.51. N.12. P. 949-954.

104. Sutherland A.D. Bell C. Limond A. Deakin J. Hunter E.A. The Biotrace method for estimating bacterial number in milk by bioluminescence. // J. Society of Dairy Technology. 1994. V.47. N.4. P. 117-121.

105. Han S.H. Kim C.H. Kim J.B. Shin H.K. Lee S.B. Determination of bacterial number in milk by ATP assay monitored by lu'ciferin-luciferase bioluminescence reaction. // Korean J. Animal Science. 1985. V.27. P.782-784.

106. Bossuit R. A 5-minute ATP platform test forjudging the bacteriological quality of raw milk. // Netherlands Milk and Dairy J. 1982. V.36. P.355-364.

107. Botha W.C. Luck J. Jooste P.J. The application of adenosine triphosphate method as a rapid bacteriological platform test. // South African J. Dairy Technology. 1985. V.17. P.59-64.

108. Langeveld L.P.M. van der Waals C.B. De ATP-verschilmethode en de microscopishe telmethode voor de kwaliteitscontrole van rauwe melk. // Voedingsmiddelentechnologie. 1987. V.19. P.20-23.

109. Van Crombrugge J. Waes G. Methods for assessing the bacteriological quality of raw milk from the farm. // Bulletin of the International Dairy Federation. 1991. N.256. P.53-60.

110. Popescu С. Balazs D. Tasca G. Pitur I. etc. The preservationof viability of BCG vaccine freeze-dried in a new exracellular protector, evaluated by ATP-dependent bioluminescence assay. // Cryo-Letters. 1999. N.20. P.71-76.

111. Sutherland A.D. Bell C. Limond A. Deakin J. // J. Soc. Dairy Technol. 1994. V.47. N.4. P.l 17-120.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.